作者：杜林 李蓮 單位：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 中山大學(xué)生命科學(xué)院

我們的初步研究表明，線粒體產(chǎn)生的活性氧和甲酸誘導(dǎo)的酵母細胞死亡關(guān)系密切［9］。因此，我們推測，降低酵母菌線粒體活性，抑制活性氧的產(chǎn)生，可以增強釀酒酵母對甲酸的抗性。儀器與設(shè)備恒溫?fù)u床(哈爾濱東明儀器HZQ－C);培養(yǎng)箱(Thermo);流式細胞儀(VantageSE，BDBiosci-ences)。酵母菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基釀酒酵母BY4741由美國Rochester大學(xué)的Da-vidGoldfarb教授惠贈。釀酒酵母W303－1a野生型菌株由中山大學(xué)微生物遺傳實驗室提供，W303－1a背景ATP酶4亞基基因缺失株由中山大學(xué)微生物遺傳實驗室構(gòu)建。YPD液體培養(yǎng)基:2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%D－(+)－葡萄糖，分裝后121℃高壓滅菌20min。

酵母細胞的培養(yǎng)及甲酸處理后的酵母細胞存活率測定取對數(shù)期釀酒酵母細胞培養(yǎng)液0.5mL，接種至裝于250mL三角瓶中的50mLYPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃，200r/min往復(fù)式振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞至對數(shù)期或穩(wěn)定期，分別取1mL菌液于1mL離心管中，立即加入相應(yīng)摩爾濃度的甲酸，30℃處理40min后，在YPD培養(yǎng)基上以標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法計數(shù)，每一稀釋度涂3個平板，以3次獨立的實驗結(jié)果計算存活率。

細胞內(nèi)活性氧爆發(fā)的流式細胞儀檢測細胞質(zhì)中活性氧檢測:取5mLYPD加入試管中，接入50μL過夜培養(yǎng)的酵母菌液，搖床培養(yǎng)6h(30℃，200r/min)。吸取以DMSO為溶劑的10mmol/L雙乙酸二氯熒光黃(dichlorofluoresceindiace-tate，DCFH-DA)溶液2μmol/L，使染色時DCFH-DA的工作濃度為20μmol/L，避光孵育15min，使DCFH-DA充分進入細胞。根據(jù)需要，迅速加入一定量的1mol/L甲酸，室溫或培養(yǎng)箱恒溫避光處理，根據(jù)實驗要求，分別吸取100μL處理中的各樣品菌液加入FACS管中，加入900μL冷藏的PBS，立即以流式細胞儀上樣分析。所用氬離子激光器激光波長為488nm，在530nm檢測激發(fā)出的熒光，以流式細胞儀FL－1通道進行檢測?；蚣尤隤I后以FL－1和FL－2通道檢測。超氧陰離子的檢測:先以無菌DMSO配置10mmol/L的超氧化物陰離子熒光探針二氫溴化乙錠(Dihydroethidium，DHE)溶液，取0.5μL加于1mL菌液，使DHE的終濃度為5μmmol/L，30℃避光孵育15min，加入相應(yīng)濃度甲酸避光處理，以流式細胞儀FL-2通道進行分析。激發(fā)光波長為535nm，發(fā)射光波長為610nm。

甲酸處理導(dǎo)致線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生與自由基的擴散為了了解活性氧爆發(fā)時細胞內(nèi)超氧陰離子及細胞質(zhì)內(nèi)過氧化氫等活性氧的水平，故使用活性氧熒光探針DCFH-DA和DHE同

時對甲酸處理時細胞中的活性氧進行檢測。由圖1可見，在用甲酸處理10min時，以熒光探針DCFH-DA和DHE依次檢測到活性氧的產(chǎn)生。細胞內(nèi)DHE陽性率超過DCFH-DA的陽性率，顯示DHE氧化后的熒光先產(chǎn)生。這和兩種熒光染料的特性有關(guān)，DHE可檢測線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子，DCFH-DA可反映細胞質(zhì)中的活性氧水平。線粒體電子傳遞鏈障礙導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生時，超氧陰離子首先產(chǎn)生。所以實驗中首先檢測到較多的細胞產(chǎn)生了超氧陰離子，而此時以DCFH-DA檢測到的細胞質(zhì)活性氧陽性的細胞卻比超氧陰離子陽性的細胞少，說明細胞質(zhì)內(nèi)的活性氧是由線粒體內(nèi)超氧陰離子擴散形成。

還原劑預(yù)處理對活性氧爆發(fā)及存活率的影響N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，是細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體，因為能夠快速穿過細胞膜，因此是一種細胞生物學(xué)研究中廣泛使用的還原劑。NAC可在細胞內(nèi)形成含巰基的代謝產(chǎn)物，促進GSH的合成，消除自由基。在用甲酸處理酵母細胞，使其細胞內(nèi)活性氧爆發(fā)前我們先用NAC預(yù)處理細胞，使其細胞內(nèi)NAC達到較高濃度以抑制活性氧的水平，檢測抑制活性氧對細胞存活率的影響。由圖2可見，和對照相比，2mmol/L的NAC預(yù)處理明顯降低了死亡率，說明細胞內(nèi)還原劑的增加，活性氧的抑制可降低甲酸處理后細胞的死亡率。有可能是由于NAC減少了活性氧，從而抑制了活性氧對酵母細胞的損傷。另外，使用PI染色后流式細胞儀分析細胞膜完整性的方法也證明NAC預(yù)處理可以降低甲酸處理后的酵母細胞死亡率。

釀酒酵母線粒體活性對甲酸處理下細胞存活率的影響在病理和生理條件下，通常線粒體都是活性氧的主要來源。線粒體電子傳遞鏈的障礙，往往導(dǎo)致活性氧的大量形成。而在不同遺傳性狀的釀酒酵母細胞中，或同一種細胞處在不同的生長條件下，其線粒體活性往往有很大差異［10］。因此我們對不同類型釀酒酵母細胞中活性氧的爆發(fā)及細胞死亡情況進行了研究。

酵母細胞菌齡對甲酸處理時細胞死亡率的影響和穩(wěn)定期細胞相比，對數(shù)期的酵母細胞代謝更為旺盛，其線粒體活性更高，因此我們推測同濃度甲酸在對數(shù)期酵母細胞中能導(dǎo)致更猛烈的活性氧爆發(fā)，從而對細胞造成更大的破壞，因此用甲酸處理培養(yǎng)24h的穩(wěn)定期細胞時活性氧產(chǎn)生情況，并比較培養(yǎng)6h的對數(shù)期細胞和培養(yǎng)24h的穩(wěn)定期細胞在同濃度甲酸處理時的存活率。由圖3可見，對數(shù)期細胞對甲酸的敏感程度比穩(wěn)定期細胞高得多，這在甲酸濃度較高時更為明顯。故甲酸的毒性和酵母細胞的代謝狀態(tài)密切相關(guān)。因此可以認(rèn)為，對數(shù)期細胞由于處于代謝旺盛的特點，其細胞內(nèi)較高活性的線粒體在甲酸處理下產(chǎn)生更多的活性氧，從而導(dǎo)致更多的對數(shù)期細胞死亡。

低溫預(yù)處理對甲酸誘導(dǎo)的細胞死亡率的影響由于線粒體的產(chǎn)能速度和微生物細胞外環(huán)境密切相關(guān)，即細胞外因素會影響線粒體活性，因此我們推測低溫預(yù)處理降低線粒體活性后，再以甲酸處理細胞，這時線粒體活性氧爆發(fā)應(yīng)該減弱，細胞的死亡率應(yīng)該下降。故在加入甲酸之前，先將細胞置于4℃10min，再將其和正常培養(yǎng)的對照樣品同時加入甲酸處理40min，然后以標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法比較二者的存活率。在本實驗中，我們還對另一實驗室研究常用的釀酒酵母BY4741進行了測定。由圖4可見，短時間的低溫預(yù)處理，即可明顯提高甲酸處理后的細胞存活率。該結(jié)果也表明，甲酸誘導(dǎo)細胞死亡和細胞的代謝狀態(tài)有關(guān)。

線粒體呼吸缺陷對甲酸處理細胞存活率的影響ATP酶結(jié)構(gòu)上的缺陷會影響其合成ATP的能力及線粒體的整體活性。所以我們通過敲除ATP酶亞基基因的方法，降低線粒體的活性，以期減弱甲酸誘導(dǎo)的活性氧的爆發(fā)并提高細胞存活率，并采用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法對同濃度甲酸處理后野生型和ATP酶4亞基缺失株的存活率進行了比較。由圖5可見，線粒體缺陷會大大提高細胞的存活率，分析其原因，推測是在線粒體活性較低的情況下，甲酸誘導(dǎo)其產(chǎn)生的活性氧較少，故活性氧對細胞的破壞較小，所以細胞的存活率明顯上升。此外，我們還發(fā)現(xiàn)位于線粒體外膜的AIF基因缺失后，其線粒體膜電位會下降，同時細胞對甲酸的抗性也會增強(數(shù)據(jù)未列出)。