作者：王兵 單位：西安工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院

１材料與方法

１．１動物模型的建立

健康雄性ＳＤ大鼠６０只，體重約２００～２５０ｇ．室溫２０～２２℃，相對濕度保持在４５％～５５％之間，動物飼養(yǎng)房采取１２ｈ黑暗與１２ｈ光照交替循環(huán)的模式．實驗大鼠購入后先適應(yīng)性飼養(yǎng)ｌ周后，將大鼠隨機分為安靜對照組（Ｃ組）、中等強度運動組（ＭＥ組）和大強度運動組（ＨＥ組），每組２０只．安靜對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不加干預(yù)．運動組在電動鼠類跑臺上進行不同強度的運動訓(xùn)練，持續(xù)８周，每周訓(xùn)練６天，訓(xùn)練強度參照Ｂｅｄｆｏｒｄ［３］的運動負荷標(biāo)準(zhǔn)．運動強度分級為：中等強度運動的大鼠跑速１２ｍ／ｍｉｎ、大強度運動的大鼠跑速１８ｍ／ｍｉｎ，持續(xù)時間２０ｍｉｎ，隔日增加速度分別至１５ｍ／ｍｉｎ和１８ｍ／ｍｉｎ增加時間３０ｍｉｎ，依次累加，當(dāng)跑速分別達２０ｍ／ｍｉｎ和３０ｍ／ｍｉｎ，時間６０ｍｉｎ后，跑臺傾斜５°，維持此強度運動，５ｄ／ｗ，持續(xù)８ｗ結(jié)束．

１．２試劑與儀器

１．２．１試劑采用ＡＭＰＫα１／２抗體，β—ａｃｔｉｎ抗體，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑．

１．２．２主要儀器采用ＭＩＮＩ－ＰＲＯＴＥＩＮ垂直電泳糟，低溫高速離心機，Ｏｄｙｓｓｅｙ紅外掃描儀，勻漿機（ＰＴ－ＭＲ２１００，ＣＥ）．

１．３蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）分析ＭＥ組和ＨＥ組于訓(xùn)練結(jié)束后２４ｈ內(nèi)進行，大鼠戊巴比妥鈉（注射量為：４０ｍｇ／１００ｇ體重）進行腹腔注射麻醉后，暴露大鼠的胸腔并取出心臟，將其放入生理鹽溶液進行血液洗凈．依據(jù)現(xiàn)有文獻資料，從左心室心尖部位剪取少量的心肌組織，按每ｌｍｇ心肌組織加入４０μＬ勻漿緩沖液內(nèi)，用勻漿機制備成勻漿．將肌肉勻漿分裝于準(zhǔn)備好的離心管中，溫度定位８０℃，持續(xù)加熱５ｍｉｎ，置于－２０℃冰箱保存［４］．使用時先進行解凍，１００℃持續(xù)加熱５ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ后即刻取上清液進行上樣．蛋白分離我們采用的是ＳＤＳ－ＰＡＧＥ系統(tǒng)，采用Ｌａｅｍｍｌｉ積層膠（濃度為４％）的及濃度為１０％的分離膠，每道上樣孔加樣約為３ｇ的蛋白質(zhì)樣品，在２０ｍＡ／ｇｅｌ的恒流電下進行電泳，后轉(zhuǎn)膜．轉(zhuǎn)膜完畢取出膜放入封閉緩沖液中封閉６０分鐘后．放入一抗（１∶１０００稀釋）中，４℃搖動過夜．一抗孵育結(jié)束后，ＴＢＳ清洗．將膜置于二抗（１∶１００００稀釋）室溫避光輕搖１ｈ，ＴＢＳ清洗［５］．使用推廣度較高的Ｏｄｙｓｓｅｙ紅外掃描儀，選擇激發(fā)波長（ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ，７００ｎｍ）對整個膜進行掃描，并得出最終的實驗結(jié)果．

１．４圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用傳統(tǒng)的Ｉｍａｇｅ軟件對所有圖像進行分析，選擇樣本目標(biāo)條帶，測定條帶光密度．用Ｏｒｉｇｉｎ７．０軟件對實驗蛋白進行半定量分析．各組有效實驗數(shù)據(jù)均采用ｍｅａｎ＋ＳＥＭ的形式表示，并使用ＳＰＳＳ社會統(tǒng)計學(xué)軟件對隨機區(qū)組的有效設(shè)計資料進行方差分析．ｐ＜０．０５時認為差異有顯著性．

２結(jié)果與分析

２．１一般狀況實驗過程中，各組大鼠自由進食和飲水，飲食與尿量均無異常、體重按計劃（１．３％～１．５％的增長速度）增長、毛色光滑亮澤、自主活動無異常、零死亡．飼養(yǎng)房室溫控制在２２℃～２４℃，濕度３５％～５５％，遵循自然光日照時間（７：００～１９：００）．

２．２各組大鼠心肌組織中ＡＭＰＫ表達圖１結(jié)果顯示β?ａｃｔｉｎ為內(nèi)參蛋白表明各孔道蛋白上樣量基本相同．相對于同步對照組，中等強度運動組（ＭＥ組）和大強度運動組（ＨＥ組）ＡＭＰＫ含量表達升高．大強度運動組（ＨＥ組）升高較明顯．在真核細胞中ＡＭＰＫ是一種異源三聚體形式存在包括催化亞基α和調(diào)節(jié)亞基β?γ．α亞基含有一個Ｎ端激酶結(jié)構(gòu)域和一個Ｃ端結(jié)構(gòu)域，Ｎ端是催化核心部位，Ｃ端負責(zé)與β和γ亞基結(jié)合．Ｃ端還含有變構(gòu)結(jié)合位點，參與和ＡＭＰ的結(jié)合．β亞基是一個腳手架結(jié)構(gòu)其Ｎ端負責(zé)ＡＭＰＫ與膜相互作用時的定位，中間部分為一段糖原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ＧＢＤ）Ｃ端ＫＩＳ和ＡＳＣ分別與α和γ亞單位結(jié)合［６］，γ亞基包括核苷酸結(jié)合區(qū)［７］，心肌中α２活性遠高于α１，大鼠大強度運動骨骼肌ＡＭＰＫ表達顯著增加，中等強度卻沒有增加［８］，研究發(fā)現(xiàn)：心肌在大強度運動中ＡＭＰＫ表達顯著增加，與骨骼肌表達一致；運動可能增加ＡＭＰ量，而降低磷酸肌酸量［９］使ＡＭＰＫ容易變構(gòu)激活［１０］，最近研究認為單次中等強度的刺激骨骼肌ＡＭＰＫα２活性增加明顯［１１］．ＤａｖｉｄＬ．Ｃｏｖｅｎ等發(fā)現(xiàn)大鼠單次運動，其骨骼肌ＡＭＰＫα１和ＡＭＰＫα２都隨運動強度增加而增加，且ＡＭＰＫα２增加更明顯［１２］，在我們研究中心肌α２亞基在不同強度訓(xùn)練中表達與ＡＭＰＫ總量的表達基本一致．現(xiàn)有研究表明：在整個運動過程中，隨著心臟做功的增加，心肌收縮力，心率，血壓都在增加，這些都可能激活ＡＭＰＫ［１３］，但心肌ＡＭＰＫ表達增加的具體機制還不太清楚，有待以后進一步研究．

２．３ＡＭＰＫ在運動中作用圖２結(jié)果顯示與同步對照組相比，中等強度運動組ＡＭＰＫ１（ＭＥ組）呈升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，（ｐ＞０．０５）而大強度運動組（ＨＥ組）與中等強度運動組（ＭＥ組）相比，有統(tǒng)計學(xué)意義，（ｐ＜０．０５）圖３結(jié)果顯示：與同步對照組相比，中等強度運動組（ＭＥ組）有統(tǒng)計學(xué)意義，（ｐ＜０．０５）而大強度運動組（ＨＥ組）與中等強度運動組（ＭＥ組）比呈升高趨勢，有統(tǒng)計學(xué)意義，（ｐ＜０．０５）心臟有著非常高的能量需求，２４ｈ所產(chǎn)生和消耗的能量（ＡＴＰ）遠高于其他臟器．心臟中的能量儲備非常低，一但ＡＴＰ產(chǎn)生停止，則數(shù)秒內(nèi)心臟中的ＡＴＰ供應(yīng)就會完全耗竭，所以ＡＭＰＫ作為能量代謝中心感受器和調(diào)節(jié)器的作用在心臟中顯得尤為重要，在缺血、缺氧、高血壓等刺激下，使心肌ＡＭＰＫ活化，促進線粒體對脂肪酸攝取和氧化［１４］，還能提高葡萄糖攝取和糖酵解．一方面可調(diào)節(jié)細胞生長和增生，細胞膜，線粒體再生及細胞凋亡和自噬盡管長時間的運動中ＡＭＰＫ在脂肪酸氧化中起的作用還不確定，但是單次運動中ＡＭＰＫ可導(dǎo)致骨骼肌的丙二酰ＣＯＡ減少，脂肪酸氧化增加，另一方面ＡＭＰＫ通過減少細胞內(nèi)吞作用增加肌纖維膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（ＧＬＵＴ４）數(shù)量，從而增加細胞對葡萄糖的攝取和利用．有利于提高運動員的運動成績．運動員ＡＭＰＫ表達增高后，機體產(chǎn)能增加，可以提高運動水平，但ＡＭＰＫ的上下游信號通路需我們進一步研究的．