同義替換速率（ｄＳ）或非同義替換的速率（ｄＮ）是一年中或一個世代內一個同義位點上發生同義替換的數目或一個非同義位點上發生非同義替換的數目。實際上，由于不知道２個序列的分歧時間，因此，習慣上總是考慮一對序列的平均每個同義位點上發生同義替換的數目或平均每個非同義位點上發生非同義替換的數目。ｄＳ等于ｄＮ時（即ω＝１），表明沒受到自然選擇；ｄＳ大于ｄＮ時（ω＜１）表明受到負選擇；ｄＳ小于ｄＮ時（ω＞１）表明受到正選擇［１］。光敏色素（Ｐｈｙ）是一類紅光／遠紅光受體，在植物整個生長發育過程中都起重要的調節作用［２－４］。Ｐｈｙ分子是由大約１１００個氨基酸殘基的脫輔基蛋白和１個線性的四吡咯環生色團通過共價鍵鏈接構成。其Ｎ端是光感受區，包括后色膽素裂解酶亞結構域（Ｂｉｌｉｎｌｙａｓｅｄｏｍａｉｎ，ＢＬＤ）和光敏色素亞結構域（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｄｏｍａｉｎ，ＰＨＹ），ＧＡＦ（ｃＧＭＰ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ／ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅｓ／ｆｏｒｍａｔｅｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）結構域包含于ＢＬＤ結構域中，是發色團結合的部位，高度保守［５－６］；Ｃ端是光調節區，光調節區域含有２個ＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）同源重復序列和１個組氨酸激酶類作用區（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｄｏｍａｉｎ，ＨＫＲＤ）。研究表明，ＧＡＦ結構域某些位點發生突變，可能會嚴重影響脫輔基蛋白和發色團的結合［７］，從而影響光敏色素的生理功能。試驗的前期研究發現，在裸子植物ＰＨＹ進化過程中，ＧＡＦ結構域中存在２個正選擇位點［８］，但是并未涉及Ｃ端的其它結構域。ＰＨＹＢ存在于被子植物，和裸子植物中的ＰＨＹＰ同為Ｂ類光敏色素基因。Ｙａｎｇ等［９］和Ｍａｔｈｅｗｓ等［１０］在對被子植物光敏色素Ａ－Ｃ／Ｆ基因以及光敏色素Ｂ－Ｄ／Ｅ基因的分析中檢測到了正選擇。但是Ｙａｎｇ等選用的基因序列有限，每個光敏色素類型只有１條基因序列。樣本的大小可能會影響檢測結果。因此，現在前期研究工作的基礎上，采用１６條光敏色素基因序列，檢測了分別存在于裸子植物和被子植物中同為Ｂ類光敏色素的ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ基因的光感受區，以期了解這２個基因的光感受區是否經歷選擇壓力以及經歷同樣的選擇壓力，從而深化對該區域功能的認識。

１材料與方法

１．１試驗材料

試驗采用了８條裸子植物的ＰＨＹＰ光感受區序列，８條被子植物的ＰＨＹＢ光感受區序列進行適應性進化分析。其中被子植物的序列數據以及外類群風兜地錢（ＭａｒｃｈａｎｔｉａｐａｌｅａｃｅａＢｅｒｔｏｌ．ｖａｒ．ｄｉｐｔｅｒａ（Ｍｏｎｔ．）Ｈａｔｔ．）的序列數據取自ＧｅｎＢａｎｋ（序列名稱及登陸號見表１）；裸子植物序列由測序所得，植物材料均采自中國科學院武漢植物園。

１．２總ＤＮＡ提取、ＰＣＲ、克隆和測序

用于ＤＮＡ提取的材料為新鮮的葉片，方法采用改進的ＣＴＡＢ法［１１］。擴增ＰＨＹＰ光感受區序列采用的引物是根據王靜得到的南方紅豆杉ＰＨＹＰ序列（數據未發表）和歐洲赤松ＰＨＹＰ的ｃＤＮＡ序列（Ｘ９６７３８）設計，引物為２對（表２），第１對擴增ＢＬＤ結構域的序列，第２對擴增了ＰＨＹ－ＰＡＳ１結構域的序列。測序完成后，光感受區域序列由這２個部分通過Ｅｄｉｔｓｅｑ軟件拼接而成。每２５μＬＰＣＲ反應體系中包括：模板５０ｎｇ，引物各８ｐｍｏｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶２Ｕ（Ｔａｋａｒａ，大連）和由Ｔａｋａｒａ提供的１０倍ＰＣＲ緩沖液２．５μＬ及２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．５μＬ。聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）在ＢｉｏｍｅｔｒａＰＣＲ擴增儀上進行（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｏ，德國）。ＰＣＲ反應程序為：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃６０ｓ，７２℃９０ｓ，３５個循環；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產物在１．０％瓊脂糖凝膠、１×ＴＡＥ電泳液中電泳３５ｍｉｎ（電壓為１２０Ｖ），切下目的片段，用ＱＩＡＥＸＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，德國）柱式ＤＮＡ膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產物。回收所得產物與ＰＭＤ１９－Ｔ載體在４℃下連接１６ｈ，然后轉化導入由大腸桿菌ＤＨ－５α所制的感受態細胞。感受態細胞在含有Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和氨芐青霉素的ＬＢ瓊脂平板培養基上培養１２ｈ，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆。至少有３個陽性克隆送至英俊公司，用ＡＢＩ３７７型自動測序儀測序，測序引物為Ｍ１３＋／Ｍ１３－。為了保證測序的準確性，對所得序列的正、反鏈進行測定并加以校準。

１．３數據分析

根據文獻［１２］，對ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ的分析是以地錢類風兜地錢為外類群。序列經ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１［１３］軟件比對，個別位點進行適當人工校正。采用最大簡約法（ＭａｘｉｍｕｍＰａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）構建分子系統樹。空位（Ｇａｐ）被編碼為缺失（Ｍｉｓｓｉｎｇ）。ＭＰ分析使用ＰＡＵＰ［１４］軟件進行，采用如下選項：樹二組重新連接（ＴｒｅｅＢｉｓｅｃｔｉｏｎ－ｒｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ＴＢＲ）、啟發式搜索（Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃｓｅａｒｃｈ）、多重性選擇（ＭＵＬＴＲＥＥＳｏｐｔｉｏｎ）、ＡＣＣＴＲＡＮ優化和１００次隨機附加的重復。利用自展分析（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，１０００次重復）檢驗各分支的置信度。在該研究中，采用ＰＡＭＬ４［１５］分析方法中的３個模型：分支模型［１６］、位點模型［１７－１８］以及分支－位點模型［１９－２０］進行分析。采用系統發育分析得到的ＭＰ樹文件，以及該分析中的密碼子矩陣。目的分支在圖１中以字母標出，ω０是背景比率。整個分析采用ＰＡＭＬ４軟件包中的Ｃｏｄｅｍｌ程序完成。

２結果與分析

２．１構建的系統發育樹

圖１是基于裸子植物ＰＨＹＰ和被子植物ＰＨＹＢ光感受區序列構建的ＭＰ樹，這２個類型的光敏色素分別聚在不同的２個分支。在ＰＨＹＰ分支中，紅豆杉＋白豆杉與香榧＋穗花杉形成姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝８３），然后和三尖杉聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝９５），池杉和柳杉＋日本柳杉形成一個分支且得到有力支持（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），該分支同紅豆杉科和三尖杉科聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），共同構成歐洲赤松的姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。在ＰＨＹＢ分支中，單子葉植物水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＪａｐｏｎｉｃａ）＋高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）形成一個分支，雙子葉植物馬鈴薯（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，ｔｏｍａｔｏ）、楊（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ）、擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）形成另外一個分支，支持率很高（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。