結(jié)核病（TB）為結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteri－umtuberculosis）引起的慢性傳染病，據(jù)WHO估計，目前全世界約有1/3的人受到結(jié)核菌感染，每年新發(fā)病例800萬，死亡人數(shù)達(dá)200萬（Kochi，1991）。我國結(jié)核病疫情非常嚴(yán)重，為全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，現(xiàn)有結(jié)核病患者451萬，其中菌陽肺結(jié)核病人200萬，耐藥結(jié)核病占27.8%，多重耐藥結(jié)核（MDR-TB）為10.7%（端木宏謹(jǐn)，2002；劉紅宇等，2002）。目前標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核病療法周期長且較為復(fù)雜，對于免疫抑制的患者效果不好，所以迫切需要發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核藥物先導(dǎo)化合物，開發(fā)能有效治療MDR-TB和潛伏性結(jié)核桿菌感染、縮短治療周期的藥物（Nayyaratal，2005；Lluis，2005）。

海洋微生物是重要藥物資源（Wagneretal，2002；Kelecom，2002；Prokschetal，2002）。紅樹林是熱帶、亞熱帶潮間帶陸海交匯的海灣河口地區(qū)特有的生態(tài)系統(tǒng)，其特點是咸淡水交迭，規(guī)律性地受到海水浸泡和露空，這一特殊的生態(tài)環(huán)境造就了豐富而特有的微生物資源（林鵬，1997），被認(rèn)為是分離放線菌的理想環(huán)境（Jensenetal，1995；閆莉萍等，2005；張喬民等，1997），陳華（2006），劉穎（2007）對從海南、廣西與廣東三省的紅樹林區(qū)廣泛采集紅樹林生態(tài)環(huán)境中的各種生物樣品如土壤、植物的根、葉和果，紅樹林底棲動物等，采用分離純化后的微生物或不經(jīng)分離的混合微生物發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），白色念珠菌（Candidaal－bicans）、黑色素瘤B16及子宮頸癌Hela等細(xì)胞毒活性等篩選，證明紅樹林微生物是很好的藥物資源，同時還得出土壤樣品來源的活性放線菌比例要高于根、葉、果及底棲生物樣品來源的活性菌株比例。肖靜等（2008）從福建漳州紅樹林保護(hù)區(qū)采集土壤樣品中分離到163株放線菌，用5種指示菌和3種腫瘤細(xì)胞測定它們的抗菌活性和抗腫瘤活性，結(jié)果表明，其中42.3%的放線菌發(fā)酵液具有單一或多種抗菌活性，37.4%的放線菌發(fā)酵液具有單一或多種抗腫瘤細(xì)胞毒活性。以上這些實驗結(jié)果，都顯示了紅樹林土壤放線菌有巨大的藥用潛力。但是，關(guān)于紅樹林土壤放線菌抗分枝桿菌潛力從未被過報道。

本研究采集了廣東珠海、深圳紅樹林保護(hù)區(qū)及惠州白沙村、陽江的蓮北村、紅光村、北津村等四個原生態(tài)的紅樹林保護(hù)區(qū)不同紅樹植物根部土壤，對其可培養(yǎng)的放線菌的多樣性進(jìn)行了初步分離研究，并以天然耐藥的恥垢分枝桿菌（Mycobacteri－umsmegmatis）做指示菌，對分離得到的放線菌進(jìn)行抗分枝桿菌活性篩選，旨在尋找新型的抗耐藥性結(jié)核菌先導(dǎo)化合物。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品

土壤樣品分別采自珠海市淇澳島紅樹林保護(hù)區(qū)，深圳市福田區(qū)紅樹林鳥類自然保護(hù)區(qū)，惠州市惠東縣鹽洲鎮(zhèn)白沙村，陽江市陽東縣東平鎮(zhèn)蓮北村，陽江市陽西縣程村鎮(zhèn)紅光村，陽江市陽東縣雅韶鎮(zhèn)北津村原生態(tài)紅樹林保護(hù)區(qū)，采樣位置選擇不同紅樹植物根部附近。

1.1.2放線菌分離培養(yǎng)基（朱九濱等，2005）

改良高氏（Gause′）sⅠ號，其中添加重鉻酸鉀作為真菌抑制劑，培養(yǎng)基中還添加了50%陳海水。

1.1.3指示菌及抗分枝桿菌活性篩選培養(yǎng)基（莎姆布魯克，2005）

指示菌：恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmeg－matis），購自中國科學(xué)院微生物研究所，篩選時采用的培養(yǎng)基是，LB培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基。

1.1.4篩選樣品發(fā)酵培養(yǎng)基

用作活性篩選的放線菌采用高氏（Gause′s）Ⅰ號培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加50%陳海水。

1.2方法

1.2.1土壤樣品采集方法（陳華等，2006）

在離目標(biāo)樹種0.5~1m的范圍內(nèi)，用經(jīng)過高壓滅菌的鋼鏟采集離地面5~20cm處的土壤，土壤樣品采集后保存于無菌培養(yǎng)皿中，置于冰上保存，編號，注明采樣時間、地點、植物種類等，于當(dāng)天運回實驗室分離。

1.2.2放線菌分離純化方法（Hayakawa，2004）

土壤樣品預(yù)處理方法：稱取1g新鮮土壤樣品到10ml的無菌水中，加入6%酵母浸膏和0.05%SDS（5mmol/L磷酸緩沖液），于40℃振蕩20min，轉(zhuǎn)速為200rpm，備用。用移液槍吸取100μl處理好的樣品懸浮液到瓊脂平板上，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面涂布均勻，并于28℃恒溫培養(yǎng)1~4周，挑取不同放線菌菌落于新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并對菌株進(jìn)行劃線純化。

1.2.3篩選樣品制備（Smedsgaard，1997a，1997b）

將分離到的紅樹林放線菌用接種針挑取少許菌體接種到篩選培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)約7d以上，將培養(yǎng)基連同菌體全部刮下置于100mL燒杯中，加入100ml甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯混合溶劑（3∶2∶1，v/v/v）超聲提取2次，每次超聲90s，提取液過濾，合并濾液，減壓蒸干溶劑，在浸膏中加入甲醇，配成含量為10mg/mL的待篩選樣品。

1.2.4抗分枝桿菌活性篩選方法（Laietal，2009）

抗分枝桿菌活性篩選采用K-B法：吸取0.5ml恥垢分枝桿菌懸液至小試管，用相對應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋到5ml，取100μl稀釋菌液到相應(yīng)培養(yǎng)基平板上涂布均勻，作為測定平板。取10μl待篩選樣品，滴加在直徑6mm的濾紙片上，把含有受試樣品的濾紙片放入已制好的測定平板上，于37℃恒溫倒置培養(yǎng)1~2d，觀察出現(xiàn)的抑菌圈情況。空白對照采用甲醇。

2結(jié)果與分析

2.1放線菌分離結(jié)果與分析

本研究樣品的采集地是珠海市淇澳島、深圳市福田區(qū)紅樹林保護(hù)區(qū)以及惠州市惠東白沙村、陽江市的蓮北村、紅光村、北津村這四個原生態(tài)紅樹林保護(hù)區(qū)，涉及到的紅樹樹種有老鼠?（Acanthusilicifolius），白骨壤（Avicenniamarina），無瓣海桑（Sonneratiaapetala），木欖（Bruguieragymnor－rhiza），鹵蕨（Acrostichumaureum），海桑（Son－neratiaeCaseloaris），秋茄（Kandeliacande）l，桐花樹（Aegicerascorniculatum），車桑子（Dodonaeaviscosa（Linn）.），銀葉樹（HeritieralittoralisDryand）.，海芒果（Cerberamanghas），角果木（Ceriopstaga）l，紅海欖（Rhizophorastylosa）等專屬性紅樹植物及苦楝（Meliaazedarach），海漆（Excoecariaagallocha），魚藤（DerrisLou）r等伴生紅樹植物，共采集泥樣45份，獲得放線菌177株，分離結(jié)果見表1。