五環(huán)三萜釀酒酵母細(xì)胞工廠的構(gòu)建

　　摘要α-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇和計(jì)曼尼醇作為重要的五環(huán)三萜化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理學(xué)功能。為構(gòu)建五環(huán)三萜釀酒酵母細(xì)胞工廠，本研究運(yùn)用CRISPR/Csa9技術(shù)，分別將編碼長(zhǎng)春花來(lái)源的α-香樹(shù)脂醇合酶(CrαAS)、洋甘草來(lái)源的羽扇豆醇合酶(GgLUS)和羊蹄甲來(lái)源的計(jì)曼尼醇合酶(BfGES)的基因整合至釀酒酵母基因組上，獲得工程菌株S01、S02和S03。工程菌株在YPG培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，S01能生產(chǎn)50.7mg/Lα-香樹(shù)脂醇，S02羽扇豆醇產(chǎn)量達(dá)到45.8mg/L，S03計(jì)曼尼醇產(chǎn)量為17.6mg/L，表明五環(huán)三萜釀酒酵母細(xì)胞工廠構(gòu)建成功。進(jìn)一步在S01、S02和S03中過(guò)表達(dá)甲羥戊酸(MVA)途徑中的關(guān)鍵酶：鯊烯環(huán)氧酶(ERG1)，增加前體物質(zhì)2,3-氧化鯊烯的供應(yīng)，最終α-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇和計(jì)曼尼醇產(chǎn)量分別達(dá)96.3、91.6和38.7mg/L。本研究建立了三萜微生物合成平臺(tái)，為構(gòu)建五環(huán)三萜酸及其衍生物釀酒酵母細(xì)胞工廠奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

　　本文源自食品與發(fā)酵工業(yè) 發(fā)表時(shí)間：2021-03-23《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志，于1970年經(jīng)國(guó)家新聞出版總署批準(zhǔn)正式創(chuàng)刊，CN:11-1802/TS，本刊在國(guó)內(nèi)外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時(shí)效性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中主要欄目有：行業(yè)技術(shù)、行業(yè)動(dòng)態(tài)、政策法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)等欄目等。

　　關(guān)鍵詞α-香樹(shù)脂醇;羽扇豆醇;計(jì)曼尼醇;五環(huán)三萜;合成生物學(xué);釀酒酵母

　　三萜類化合物是一類由多個(gè)異戊二烯單位(C5H8)構(gòu)成的烴類及其含氧衍生物，通常是由30個(gè)碳原子組成。結(jié)構(gòu)上多為四環(huán)三萜或五環(huán)三萜，其中，五環(huán)三萜化合物種類較多，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，廣泛存在于植物中，具有多種藥理學(xué)功能，如齊墩果酸片等藥品已在臨床應(yīng)用于肝臟保護(hù)[1-2]。根據(jù)構(gòu)型不同，五環(huán)三萜化合物可分為烏蘇烷型(ursanegroup)、羽扇豆烷型(lupanegroup)和齊墩果烷型(oleananegroup)等。α-香樹(shù)脂醇(α-amyrin)及其衍生物是重要的烏蘇烷型五環(huán)三萜，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗真菌[5]等功效;羽扇豆醇(lupeol)及其衍生物是羽扇豆烷型五環(huán)三萜的代表，在抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有非常重要的作用;計(jì)曼尼醇(germanicol)及其衍生物屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工品等[8]領(lǐng)域。目前五環(huán)三萜化合物主要從植物中提取得到，此方法耗時(shí)、成本高、環(huán)境不友好，隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，利用微生物實(shí)現(xiàn)萜類化合物的異源生產(chǎn)得到了越來(lái)越多的關(guān)注[9-10]。

　　釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為一種安全的真核模式微生物，遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)成熟，具有生物合成萜類物質(zhì)的甲羥戊酸(MVA)途徑，其完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)更加有利于萜類合成相關(guān)環(huán)化酶和細(xì)胞色素P450氧化酶的表達(dá)，已被廣泛用于構(gòu)建生產(chǎn)天然萜類活性物質(zhì)的底盤(pán)工程菌株[11-13]。YU等[14]將α-香樹(shù)脂醇合酶MdOSC1引入釀酒酵母中，通過(guò)代謝工程改造增加前體物質(zhì)2,3-氧化鯊烯的供應(yīng)，α-香樹(shù)脂醇的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到12.0mg/L。QIAO等[15]將羽扇豆醇合酶OeLUP在釀酒酵母進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了羽扇豆醇的生物合成。ZHANG等[16]在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹(shù)脂醇合成途徑，并對(duì)其合成途徑進(jìn)行調(diào)控和發(fā)酵優(yōu)化，β-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量達(dá)138.8mg/L。在重組釀酒酵母中，五環(huán)三萜化合物是以MVA途徑產(chǎn)生的異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)為前體，依次在法呢基焦磷酸合酶(ERG20)、鯊烯合酶(ERG9)和鯊烯環(huán)氧酶(ERG1)的催化作用下生成2,3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene)，2,3-氧化鯊烯進(jìn)一步在α-香樹(shù)脂醇合酶(α-amyrinsynthase，αAS)、羽扇豆醇合酶(lupeolsynthase，LUS)和計(jì)曼尼醇合酶(germanicolsynthase，GES)的作用下生成相應(yīng)的三萜母核[8]。

　　本研究以Keasling教授惠贈(zèng)的高效積累IPP和DMAPP的釀酒酵母菌株JWy601[17]為出發(fā)菌株，運(yùn)用CRISPR/Csa9技術(shù)[18]，整合長(zhǎng)春花來(lái)源的α-香樹(shù)脂醇合酶，構(gòu)建得到α-香樹(shù)脂醇生物合成途徑;異源表達(dá)洋甘草來(lái)源的羽扇豆醇合酶，獲得產(chǎn)羽扇豆醇釀酒酵母工程菌株;引入羊蹄甲來(lái)源的計(jì)曼尼醇合酶，實(shí)現(xiàn)計(jì)曼尼醇的生物合成。進(jìn)一步通過(guò)代謝工程策略過(guò)表達(dá)MVA代謝途徑中的關(guān)鍵酶ERG1，增加前體物質(zhì)2,3-氧化鯊烯的供應(yīng)，提高五環(huán)三萜的產(chǎn)量。本研究建立了三萜微生物合成平臺(tái)，為構(gòu)建五環(huán)三萜酸及其衍生物釀酒酵母細(xì)胞工廠奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1質(zhì)粒和菌株

　　實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒和菌株信息詳見(jiàn)表1。

　　1.1.2引物

　　實(shí)驗(yàn)所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，如表2所示

　　1.1.3培養(yǎng)基

　　LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)向培養(yǎng)基中加入終濃度為100µg/mL的氨芐青霉素(Amp)或50µg/mL的卡那霉素(Kan)。酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(g/L)：酵母SC-URA培養(yǎng)基7.9，葡萄糖20。YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。YPG培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，半乳糖20。若需要固體培養(yǎng)基，向上述液體培養(yǎng)基加入20g/L瓊脂粉。

　　1.1.4主要試劑和儀器

　　GreenTaqMix和2×PhantaMaxMasterMix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司;酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;質(zhì)粒小量制備試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司;氨芐青霉素和卡那霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母SC-URA培養(yǎng)基，艾禮生物科技(上海)有限公司;α-香樹(shù)脂醇和羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司;計(jì)曼尼醇標(biāo)準(zhǔn)品，云南西力生物技術(shù)股份有限公司。

　　Bio-RadC1000TOUCH型PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司;EPS300型核酸電泳系統(tǒng)，上海天能科技有限公司;LDZM-80KCS-II型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;CT15RE型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;ZQZY-HC型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司;PegasusBT型氣相-高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)力可公司。

　　1.2方法

　　1.2.1五環(huán)三萜合成途徑的構(gòu)建

　　本實(shí)驗(yàn)所選取的表達(dá)五環(huán)三萜合成途徑相關(guān)酶的編碼基因來(lái)源情況如下：α-香樹(shù)脂醇合酶編碼基因CrαAS來(lái)源于長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)，羽扇豆醇合酶編碼基因GgLUS來(lái)源于洋甘草(Glycyrrhizaglabra)，計(jì)曼尼醇合酶編碼基因BfGES來(lái)源于羊蹄甲(Bauhiniaforficata)。以上基因由蘇州金唯智生物科技有限公司按照釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化、合成并克隆至質(zhì)粒pET28a上，得到重組質(zhì)粒：pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES。在此基礎(chǔ)上，以菌株JWy601基因組為模板，通過(guò)表2中所示的引物，分別擴(kuò)增獲得ERG1、PGAL1、TADH1和不同位點(diǎn)的上下游同源臂片段;以質(zhì)粒pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES為模板，表2中所示的序列為引物，分別擴(kuò)增獲得CrαAS、GgLUS和BfGES基因片段;同時(shí)，提取pCut-308a和pCut-1622b質(zhì)粒，用于構(gòu)建釀酒酵母五環(huán)三萜合成途徑。

　　1.2.2工程菌株的篩選

　　本研究利用的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)[18]是一個(gè)單質(zhì)粒系統(tǒng)，pCut-308a和pCut-1622b質(zhì)粒攜帶有表達(dá)Cas9蛋白的基因和靶向相應(yīng)位點(diǎn)的sgRNA，用來(lái)進(jìn)行基因的靶向整合。首先將CrαAS、GgLUS和BfGES基因分別整合至釀酒酵母基因組308a位點(diǎn)，獲得菌株S01、S02和S03;進(jìn)一步整合ERG1基因至菌株S01、S02和S03的1622b位點(diǎn)，分別獲得菌株S04、S05和S06。具體篩選方法如下所述：首先通過(guò)釀酒酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，分別把1.2.1中得到的基因片段與上下游同源臂、PGAL1、TADH1和pCut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母，利用同源重組機(jī)制實(shí)現(xiàn)PGAL1-目的基因-TADH1表達(dá)盒的組裝;接下來(lái)將轉(zhuǎn)化平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后對(duì)其進(jìn)行PCR驗(yàn)證，完成第一次篩選;最后對(duì)驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待質(zhì)粒成功消除后進(jìn)行第二次PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)最終獲得整合表達(dá)氧化鯊烯環(huán)化酶和ERG1的工程菌株。

　　1.2.3工程菌株的發(fā)酵

　　凍管菌經(jīng)YPD平板劃線活化后，接種于10mLYPD培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h;隨后轉(zhuǎn)接至50mLYPD培養(yǎng)基中，使其初始菌體濃度OD600=0.2，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h;然后離心收集菌體，更換50mLYPG培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，定時(shí)取樣對(duì)重組菌生長(zhǎng)趨勢(shì)、α香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇和計(jì)曼尼醇產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。

　　1.2.4工程菌株產(chǎn)物的提取

　　對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的樣品進(jìn)行快速提取，具體方法如下所述：取1mL發(fā)酵液，12000r/min室溫離心1min收集菌體，用等體積20%氫氧化鉀溶液(用50%乙醇配制)重懸，沸水浴10min;加入等體積正己烷萃取3次，離心取上清;用無(wú)水硫酸鈉除水后對(duì)樣品進(jìn)行硅烷化處理，轉(zhuǎn)移至氣相小瓶中用氣相-高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析。

　　1.2.5產(chǎn)物的分析與檢測(cè)

　　氣相-高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(GC-MS)測(cè)定：色譜柱為DB-5MS，載氣氦氣的流速為1.0mL/min;進(jìn)樣口溫度300℃，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1µL，分流比10:1;升溫起始溫度180℃，保持1min，然后以20℃/min升至300℃，保持14min;質(zhì)譜掃描范圍為50-600m/z。α-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇和計(jì)曼尼醇標(biāo)準(zhǔn)品用于定性和定量分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1α-香樹(shù)脂醇細(xì)胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

　　在釀酒酵母中引入植物來(lái)源的α-香樹(shù)脂醇合酶可催化2,3-氧化鯊烯生成α-香樹(shù)脂醇[14]。本研究選取來(lái)源于長(zhǎng)春花的α-香樹(shù)脂醇合酶CrαAS(GenBankID:JQ027033.1)用于構(gòu)建α-香樹(shù)脂醇細(xì)胞工廠。在釀酒酵母JWy601中整合CrαAS基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物大小與表達(dá)盒理論值大小3139bp一致，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建得到整合有α-香樹(shù)脂醇合酶CrαAS的釀酒酵母工程菌株S01。

　　工程菌株S01在YPG培養(yǎng)基中發(fā)酵96h，利用GC-MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2a所示，工程菌株S01發(fā)酵產(chǎn)物在14.24min時(shí)出現(xiàn)與α-香樹(shù)脂醇標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致的峰，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)α-香樹(shù)脂醇。工程菌株S01菌體生長(zhǎng)曲線和α-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量變化曲線如圖2b所示，誘導(dǎo)發(fā)酵48h時(shí)產(chǎn)量最高，達(dá)到50.7mg/L。

　　2.2羽扇豆醇細(xì)胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

　　羽扇豆醇合酶可以將2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成羽扇豆烷型三萜母核羽扇豆醇[15]。本研究把洋甘草來(lái)源的羽扇豆醇合酶GgLUS(GenBankID:AB116228.1)整合到釀酒酵母中，用于構(gòu)建生產(chǎn)羽扇豆醇的工程菌株。以釀酒酵母JWy601為出發(fā)菌株，把GgLUS基因整合至其基因組上，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，所得條帶大小3127bp，與表達(dá)盒理論值大小相符，測(cè)序結(jié)果也顯示表達(dá)盒構(gòu)建成功，獲得表達(dá)羽扇豆醇合酶GgLUS的釀酒酵母工程菌株S02。

　　對(duì)工程菌株S02進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，提取發(fā)酵液樣品，萃取后用GC-MS進(jìn)行定性和定量分析。總離子流色譜圖如圖4a所示，羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品在14.30min時(shí)出峰，工程菌株S02發(fā)酵產(chǎn)物在該時(shí)間點(diǎn)也出峰，表明成功構(gòu)建產(chǎn)羽扇豆醇釀酒酵母細(xì)胞工廠。工程菌株S02在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)48h時(shí)，羽扇豆醇產(chǎn)量高達(dá)45.8mg/L(圖4b)。

　　2.3計(jì)曼尼醇細(xì)胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

　　齊墩果烷型三萜母核計(jì)曼尼醇是以2,3-氧化鯊烯為前體物質(zhì)，在計(jì)曼尼醇合酶的作用下環(huán)化而成的[8]。本研究將來(lái)源于羊蹄甲的計(jì)曼尼醇合酶BfGES(GenBankID:LC464979.1)在釀酒酵母中異源表達(dá)，構(gòu)建計(jì)曼尼醇生物合成途徑。把BfGES基因整合至釀酒酵母JWy601底盤(pán)細(xì)胞中，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示，所得DNA片段大小與表達(dá)盒大小理論值一致(3148bp)，進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)計(jì)曼尼醇合成途徑構(gòu)建成功，獲得釀酒酵母工程菌株S03。

　　工程菌株S03在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，更換YPG培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，提取發(fā)酵液樣品，用GC-MS對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖6a所示，在14.36min時(shí)，計(jì)曼尼醇標(biāo)準(zhǔn)品和工程菌株S03發(fā)酵產(chǎn)物均出峰，表明產(chǎn)計(jì)曼尼醇釀酒酵母工程菌株構(gòu)建成功。由工程菌株S03菌體生長(zhǎng)曲線和計(jì)曼尼醇產(chǎn)量變化曲線圖(圖6b)可看出，計(jì)曼尼醇產(chǎn)量先快速升高，后緩慢下降，在誘導(dǎo)48h時(shí)達(dá)到最高17.6mg/L。

　　2.4過(guò)表達(dá)ERG1基因?qū)︶劸平湍肝瀛h(huán)三萜產(chǎn)量的影響

　　MVA途徑作為細(xì)胞中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為萜類化合物的第1個(gè)關(guān)鍵模塊，其活性會(huì)直接影響到細(xì)胞中萜類產(chǎn)量，其中，ERG1是釀酒酵母MVA代謝途徑中的關(guān)鍵酶。ERG1基因編碼鯊烯環(huán)氧酶，其作用是把鯊烯氧化生成2,3-氧化鯊烯。ZHANG等[19]用同源重組的方法過(guò)表達(dá)ERG1基因，提高了釀酒酵母工程菌株中達(dá)瑪二烯和原人參二醇的產(chǎn)量。

　　因此，為進(jìn)一步提高本研究構(gòu)建得到的釀酒酵母工程菌株產(chǎn)五環(huán)三萜能力，本研究在先前工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)代謝工程策略對(duì)菌株S01、S02和S03進(jìn)行了改造。即在菌株S01、S02和S03中過(guò)表達(dá)ERG1基因，分別得到菌株S04、S05和S06。工程菌株在YPG培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，結(jié)果如圖7所示，菌株S04中α-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量為96.3mg/L，是菌株S01的1.9倍;菌株S05中羽扇豆醇的產(chǎn)量達(dá)到91.6mg/L，是菌株S02的2倍;菌株S06中計(jì)曼尼醇產(chǎn)量達(dá)到了38.7mg/L，是菌株S03的2.2倍。研究結(jié)果表明增加前體物質(zhì)的供應(yīng)可顯著增強(qiáng)工程菌株五環(huán)三萜的生產(chǎn)能力。本研究獲得的菌株S04中α-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量和菌株S05中羽扇豆醇的產(chǎn)量與已有報(bào)道水平相當(dāng)，菌株S06中計(jì)曼尼醇產(chǎn)量是已報(bào)道的4.7倍，后續(xù)會(huì)開(kāi)展合成途徑與發(fā)酵工藝優(yōu)化工作提高五環(huán)三萜的產(chǎn)量。

　　3討論

　　目前三萜類化合物的合成主要是通過(guò)植物提取，成本高效率低，本研究以安全的真核模式微生物釀酒酵母為底盤(pán)細(xì)胞，分別整合不同來(lái)源的氧化鯊烯環(huán)化酶并利用代謝工程策略提高其產(chǎn)量，構(gòu)建產(chǎn)五環(huán)三萜的微生物細(xì)胞工廠。本研究獲得的工程菌株S04α-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量達(dá)到96.3mg/L，α-香樹(shù)脂醇是烏蘇烷型三萜的前體，在氧化還原反應(yīng)、酰基化、糖基化等修飾作用下，能形成結(jié)構(gòu)和功能各異的烏蘇烷三萜，其C-28位連續(xù)氧化產(chǎn)物熊果酸有抗癌、抗糖尿病及抗?jié)兘笛淖饔肹20]。工程菌株S05羽扇豆醇產(chǎn)量可達(dá)91.6mg/L，羽扇豆醇屬于羽扇豆烷型三萜化合物，其衍生物白樺脂酸被認(rèn)為是很有前景的抗腫瘤及抗HIV的候選藥物[21]。工程菌株S06可生產(chǎn)38.7mg/L計(jì)曼尼醇，計(jì)曼尼醇屬于齊墩果烷型三萜，齊墩果烷型三萜化合物具有廣泛的藥理活性，齊墩果酸[20]和甘草酸類[22]藥物制劑已在臨床應(yīng)用于肝臟保護(hù)。隨著三萜類化合物合成途徑的解析，后續(xù)研究可在產(chǎn)五環(huán)三萜骨架釀酒酵母合成途徑與發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步整合氧化三萜骨架的細(xì)胞色素P450氧化酶[23-25]，用于生產(chǎn)活性更高的三萜化合物。本研究建立了三萜微生物合成平臺(tái)，為構(gòu)建五環(huán)三萜酸及其衍生物釀酒酵母細(xì)胞工廠奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。