shRNA干擾URG11表達對骨肉瘤細胞惡性表型影響

　　[摘要] 目的 研究上調基因11(URG11)對骨肉瘤細胞(MG63)惡性表型的影響。

　　《東方食療與保健》OrientalDiet-TherapyandHealthCare(月刊)是我國目前唯一的一份以介紹藥膳食療內容為主的科普性期刊，它填補了我國藥膳食療刊物的空白。

　　方法 用URG11短發夾RNA(shRNA)重組慢病毒感染細胞，以實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測干擾效果。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)測定細胞增殖，流式細胞術測定細胞凋亡，Transwell檢測細胞侵襲和遷移，Western blot檢測裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和波形蛋白(Vimentin)等表達。

　　結果 URG11 shRNA重組慢病毒感染MG63細胞后，URG11表達下降，差異有顯著性(F=181.200、97.307，P<0.001);細胞存活率、侵襲和遷移數量降低，細胞凋亡率升高，E-cadherin、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，Vimentin、MMP-9和MMP-2蛋白表達水平降低，差異均有顯著性(F=28.064～625.516，P<0.05)。

　　結論 shRNA干擾URG11表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化，并誘導細胞凋亡。

　　[關鍵詞] 骨肉瘤;上調基因11;腫瘤侵潤;細胞運動;細胞凋亡

　　骨肉瘤是一種好發于青壯年和青少年的惡性骨腫瘤[1]，其惡性表型如增殖、凋亡、侵襲等與細胞內異常表達基因有關[2]。上調基因11(URG11)是近年來發現的參與細胞運動、增殖等過程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中發揮癌基因作用，下調URG11腫瘤生長和轉移能力減弱[4-5]。URG11在骨肉瘤組織中呈陽性表達，且與腫瘤病人分期、轉移相關，但其在骨肉瘤細胞中的作用尚不明確[6]。本實驗通過干擾URG11的表達，探討URG11對骨肉瘤細胞惡性表型的影響，為靶向URG11治療骨肉瘤提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 細胞和試劑

　　骨肉瘤細胞MG63購自上海研謹生物科技有限公司;polybrene購自美國Sigma公司;SYBR定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;陰性對照慢病毒和URG11短發夾RNA(shRNA)重組慢病毒由吉滿生物科技(上海)有限公司構建;基質金屬蛋白酶2(MMP-2)抗體、URG11抗體購自美國Abcam;裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、

　　裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。

　　1.2 慢病毒感染

　　骨肉瘤細胞以每孔5×104個接種6孔板，于培養箱內培養，細胞融合度為40%時，以MOI=20分別添加慢病毒，再加入適量的polybrene(終濃度為5 mg/L);培養12 h以后，加入新鮮培養液;培養72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，以1 mg/L的嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞系。把不感染慢病毒的細胞設置為Control組(A組)，把感染陰性對照慢病毒以及URG11 shRNA重組慢病毒的細胞分別設置為shRNA-NC(B組)、URG11 shRNA(C組)。

　　1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定干擾效果

　　A、B、C組細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行qRT-PCR。所用引物種類及其序列見表1。用SYBR定量PCR試劑盒分析URG11表達變化，計算方法為2-△△CT法，內參為β-actin。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)測定干擾效果

　　A、B、C組細胞分別用PBS洗滌2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法測定蛋白樣品濃度，每孔30 μg蛋白樣品，設置120 V的電壓電泳2 h后，從玻璃板中間取出凝膠。將PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后進行轉膜，轉膜置于4 ℃條件進行。將PVDF膜置于新配置的含體積分數0.05牛血清蛋白溶液中，在室溫結合2 h。把URG11一抗按1∶800倍稀釋，PVDF膜置于一抗反應液中孵育過夜。再將二抗按1∶2 000倍稀釋后，把PVDF膜置于二抗反應液內孵育2 h。使用ECL發光。采用Image J分析內參β-actin和目的條帶URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞增殖

　　A、B、C組細胞培養24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL細胞培養液至每個孔內培養4 h，再加入150 μL的二甲基亞砜，混合反應后，經空白孔調零。以酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度(A)值，把Control細胞的存活率設置為100%，分析其他各組細胞存活率變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

　　A、B、C組細胞中分別添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移

　　A、B、C組細胞以不含血清的培養液懸浮，細胞密度調整為7×107/L，分別添加到Transwell小室的上室內進行遷移實驗。每組添加200 μL細胞懸液，下室內添加500 μL的含血清培養液。24 h后，將小室取出，把沒有穿膜的細胞擦掉并以PBS洗滌后，分別添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光鏡下選取5個視野，計數細胞遷移數目。在侵襲實驗前以基質膠將Transwell小室濕化，其余步驟同遷移實驗。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.8 Western blot檢測細胞中相關蛋白表達變化

　　A、B、C組細胞按照1.4中Western blot方法檢測Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表達變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

　　1.9 統計分析

　　采用SPSS 21.0軟件分析實驗數據，計量資料數據用±s表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結 果

　　2.1 URG11 shRNA下調對骨肉瘤細胞中URG11表達水平影響