硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法建立

　　【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法。方法 測(cè)定硝酸咪康唑搽劑對(duì)大腸埃希菌等5種試驗(yàn)菌的回收率，對(duì)2個(gè)控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 用薄膜過濾法和0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑檢查本品的細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)，其試驗(yàn)菌回收率均達(dá)到70%以上。同樣用該方法檢查本品的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，其試驗(yàn)組呈陽性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。結(jié)論 用薄膜過濾法聯(lián)用0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑可以消除硝酸咪康唑搽劑在試驗(yàn)條件下的抑菌作用，從而順利檢出該品種所污染的各種微生物。

　　【關(guān)鍵詞】 硝酸咪康唑搽劑;微生物限度檢查;方法學(xué)驗(yàn)證;醫(yī)學(xué)期刊投稿

　　Abstract:Objective To establish a method of microbial limit test for miconazole nitrate liniment. Methods Centrifugal sedimentation and culture medium diluted method were used to validate the accuracy and feasibility of microbial limit test.Results The recovery of bacteria, yeast and mould were above 70%. P. aeruginosa and S.aureus were positive and Gramnegative organisms were negative. Conclusions Membrane filtration and the polysorbate 80 sodium chloridepeptone buffer can be used to test the total viable aerobic count and specifiedorganisms (include S. aureus and P. aeruginosa) for miconazole nitrate liniment.

　　Key words:miconazole nitrate liniment;microbial limit test;method validation

　　微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定制劑及原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查[1]。但具有抑菌成分的藥品由于其抑菌活性的干擾，常規(guī)檢查結(jié)果不能真實(shí)地反映出藥品中污染微生物的情況，必須先消除供試品中的抑菌活性，再根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查，并必須對(duì)所采取的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)抑菌活性的消除和檢查方法的可靠性。具有抑菌作用的藥品，每個(gè)品種抑菌效果不同，因此適合各個(gè)品種的微生物限度檢查法也不同。

　　作者曾用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法(用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗)對(duì)硝酸咪康唑搽劑進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均不能達(dá)到藥典要求。吐溫80是親水性表面活性劑，具有增溶作用，因此本文選擇用薄膜過濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液做沖洗劑檢查該藥品的細(xì)菌、真菌、酵母菌數(shù)和控制菌，結(jié)果滿意，可為同類藥品的微生物限度檢查法提供科學(xué)依據(jù)。

　　1材料

　　1.1菌種大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003], 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 980011], 黑曲霉(Asperg illus niger)[CMCC(F) 98003]，由廣東生物研究所提供，菌種代數(shù)均為第3代。

　　1.2培養(yǎng)基及試劑pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑、PDP瓊脂培養(yǎng)基、三氯甲烷、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基和革蘭氏染色劑。

　　1.3樣品硝酸咪康唑搽劑，阿特維斯(佛山)制藥有限公司，批號(hào)：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亞砜。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1菌液制備[1]

　　2.1.1取經(jīng)37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與大腸埃希菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.1.2取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.1.3接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.2供試液的制備[2]取本品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。

　　2.3驗(yàn)證方法

　　2.3.1細(xì)菌、真菌和酵母菌計(jì)數(shù)法回收率的測(cè)定

　　薄膜過濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3次獨(dú)立平行試驗(yàn)結(jié)果的均值見表1[3]。

　　①試驗(yàn)組：取供試液10 mL到薄膜過濾器中,用無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后1次沖洗液中加入1 mL的試驗(yàn)菌液(50～100 cfu/mL)沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上，置30～35 ℃培養(yǎng)48 h或23～28 ℃培養(yǎng)72 h。記錄菌落數(shù)。試驗(yàn)組的菌回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

　?、诰航M[4]：在過濾器中預(yù)先加入大約20 mL的無菌0.9%氯化鈉溶液，再吸取1 mL的試驗(yàn)菌液(50～100 cfu/mL)到過濾器中，過濾。再用100 mL無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次，取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同試驗(yàn)組。

　?、酃┰嚻穼?duì)照組：方法同試驗(yàn)組，但不加試驗(yàn)菌液。

　?、芟♂寗?duì)照組：方法與試驗(yàn)組同，其中供試液用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替。稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%

　　表1各試驗(yàn)菌株的回收率　略

　　從表1可知，在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率、試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%?？捎帽∧み^濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗方法檢查硝酸咪康唑搽劑的細(xì)菌、真菌及酵母菌數(shù)。

　　2.3.2控制菌檢查方法驗(yàn)證

　?、僭囼?yàn)組：取供試液10 mL到薄膜過濾器中, 用無菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗(yàn)菌(驗(yàn)證銅綠假單胞菌時(shí),試驗(yàn)菌為銅綠假單胞菌)，沖洗后取出濾膜放入預(yù)先制備好的相應(yīng)培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查。

　?、陉幮跃鷮?duì)照組：方法同試驗(yàn)組，試驗(yàn)菌改為50～100 cfu陰性對(duì)照菌(2個(gè)控制菌驗(yàn)證的陰性對(duì)照菌均為大腸埃希菌)。

　?、劬航M ：在過濾器中預(yù)先加入約20 mL的無菌0.9%氯化鈉溶液，在吸取50～100 cfu試驗(yàn)菌到薄膜過濾器中，用100 mL 0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置(36±1)℃培養(yǎng)48 h，記錄活菌數(shù)[5]。

　　3次平行試驗(yàn)結(jié)果一致，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

　　表2對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的驗(yàn)證結(jié)果　略

　　從表2可見，用薄膜過濾法聯(lián)用0.1%吐溫pH7.080氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，方法成立。

　　3討 論

　　硝酸咪康唑搽劑為廣譜抗真菌藥，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亞砜等成分，對(duì)皮膚癬菌、念珠菌等有抗菌作用，對(duì)某些細(xì)菌也有一定抑制作用?！吨袊幍洹?005版規(guī)定，對(duì)藥品在微生物限度檢查時(shí)，其方法應(yīng)通過驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品的抑菌活性已被消除而保證檢查方法的可靠性。從本品的微生物限度檢查法的建立研究可見，選用薄膜過濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液作沖洗劑來檢查本品的細(xì)菌數(shù)、真菌、酵母菌數(shù)及控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的方法有效，在細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)菌回收率均能達(dá)到70%以上;銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)組呈陽性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。本文結(jié)果可為同類產(chǎn)品的微生物限度檢查方法驗(yàn)證提供科學(xué)的依據(jù)。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥：二部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄XIJ.

　　[2] 馬緒榮，蘇德模.抑菌性供試品的供試掖制備方法[J].藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè),2001,2(2)：65.

　　[3] 王剛林，周劍.含抑制菌成分中成藥固體制劑微生物限度檢查驗(yàn)證方法的建立[J].中華實(shí)用醫(yī)藥雜志,2006,6(2):26.

　　[4] 桑國衛(wèi).中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：325.

　　[5] 林麗英，陳浩桉.大黃蟲蟅丸微生物限度檢查法的建立[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,17(7)：4.