隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，灌溉面積和灌溉用水量不斷增加，化肥施用量也不斷增加，由于灌溉技術(shù)落后和化肥的有效利用率較低，農(nóng)田灌溉退水污染成為亟待解決的問題(曹仁林和賈曉葵，2001)。寧蒙灌區(qū)地處黃河中上游，年退水30億m3，主要污染物為氮、磷和COD，其中造成超標(biāo)污染物主要為氮(張愛平等，2008)，對(duì)灌區(qū)水環(huán)境和黃河水安全構(gòu)成了嚴(yán)重影響。

人工濕地利用基質(zhì)-微生物-植物這個(gè)復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)，具有獨(dú)特而復(fù)雜的凈化機(jī)理(潘麗娟和陽小成，2008)，與傳統(tǒng)的污水處理法相比具有基建、運(yùn)行費(fèi)用低，操作與維護(hù)簡單等優(yōu)點(diǎn)(梁繼東等，2003)。微生物在人工濕地氮素的去除過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，張列宇等(2010)認(rèn)為，氨化-亞硝化-硝化-反硝化是濕地中脫氮的最主要途徑。反硝化細(xì)菌的反硝化反應(yīng)則是使硝酸鹽氮重新回到大氣的主要途徑(方芳和陳少華，2010)，因此高效反硝化細(xì)菌的獲得對(duì)人工濕地的構(gòu)建，解決農(nóng)灌退水污染具有重要意義。

研究表明，好氧反硝化細(xì)菌克服了傳統(tǒng)的反硝化細(xì)菌只能在缺氧條件下進(jìn)行反硝化作用的缺點(diǎn)，有氧生長，生長周期短，對(duì)高濃度的氮耐受力很強(qiáng)(Jooetal．，2005;周立祥等，2006)，好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為生物脫氮技術(shù)注入了新的活力。但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌為數(shù)不多(Patureauetal．，2000;黃運(yùn)紅等，2007;王弘宇等，2007)，而高效的好氧反硝化細(xì)菌則更少(朱曉宇等，2009)。已發(fā)現(xiàn)的菌株中假單胞菌屬最為常見(李衛(wèi)芬等，2011)，關(guān)于芽孢桿菌屬的報(bào)道相對(duì)較少。本研究涉及的人工濕地示范基地建在內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特前旗境內(nèi)，所在環(huán)境條件惡劣，鹽堿化程度較高，有關(guān)能夠適應(yīng)此環(huán)境的高效好氧反硝化芽孢桿菌的研究鮮見報(bào)道。

因此，本研究在天然濕地底泥中分離出高效好氧反硝化芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，確定其在分類學(xué)上的地位，并在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)細(xì)菌反硝化特性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，充分認(rèn)識(shí)濕地系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)好氧脫氮芽孢桿菌的脫氮特性，為今后工程實(shí)踐及強(qiáng)化微生物脫氮技術(shù)提供參考。

1材料與方法

1.1樣品來源

2010年6月采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏梁素海底泥，風(fēng)干，保存于紙袋中。

1.2培養(yǎng)基

菌株分離培養(yǎng)基(NA):牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。硝酸鹽還原產(chǎn)氣培養(yǎng)基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。種子培養(yǎng)基:葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4•7H2O0.5g，(NH4)2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸鈉3.32g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基:KNO32g，MgSO4•7H2O1g，KH2PO40.5g，葡萄糖10g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。菌株生理生化鑒定培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)的方法(東秀珠和蔡妙英，2001)。

1.3芽孢桿菌的分離

稱取1g樣品放入裝有9mL無菌水的試管中，80℃水浴20min，充分振蕩混勻，取1mL到下一個(gè)同樣的試管中，依次稀釋得到各種濃度的菌懸液。分別取10－5～10－73個(gè)稀釋梯度的稀釋液0.1mL涂布于NA平板上，然后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。挑取不同形態(tài)的單菌落轉(zhuǎn)接至NA斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ羧【渫瑫r(shí)在NA培養(yǎng)基平板上劃線檢驗(yàn)純度。

1.4反硝化芽孢桿菌的篩選

將1.3分離得到的菌株進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)，具體方法參照文獻(xiàn)(東秀珠和蔡妙英，2001)。對(duì)于能利用硝酸鹽并且產(chǎn)氣的試驗(yàn)菌株接種到反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃，200r•min－1，搖床震蕩培養(yǎng)，離心取上清，測(cè)定總氮含量。根據(jù)氮含量的變化進(jìn)一步確定優(yōu)勢(shì)菌株。總氮的測(cè)定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法(魏復(fù)盛等，2002)。

1.5菌株TGR30的鑒定

1.5.1形態(tài)與生理生化鑒定菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

與生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠和蔡妙英，2001)進(jìn)行。

1.5.2基因組DNA的提取及16SrDNA鑒定

參考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取細(xì)菌基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。擴(kuò)增引物為通用引物(Claudiaetal．，2002)，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序以及產(chǎn)物的檢測(cè)參照胡朝松等(2009)方法。純化后的PCR產(chǎn)物送寶瑞通生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中已登錄的16SrRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，通過CLUSTALX和BIOEDIT等軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Sai-tou＆Nei，1987)。1.6反硝化細(xì)菌TGR30的反硝化特性測(cè)定方法

1.6.1碳源

主要考察醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、可溶性淀粉、琥珀酸鈉、甘露醇、麥芽糖、乳糖對(duì)菌株反硝化特性的影響。將不同碳源分別以2%的添加量代替反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，同時(shí)有不加碳源的培養(yǎng)基作對(duì)照。將試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng)18h后按8%的接種量加入到添加不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養(yǎng)66h后取樣測(cè)定總氮含量。

1.6.2碳氮比

試驗(yàn)中C/N均以碳源與氮源的質(zhì)量比計(jì)算。反硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中KNO3濃度始終為2g•L－1，添加1.6.1小節(jié)中的最優(yōu)碳源，碳源添加量根據(jù)試驗(yàn)調(diào)整，其他成分不變。菌株培養(yǎng)方法以及取樣測(cè)定方法同1.6.1。

1.6.3鹽濃度

培養(yǎng)基中的鹽濃度以NaCl的含量計(jì)，設(shè)0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%8個(gè)梯度，將試驗(yàn)菌株經(jīng)純培養(yǎng)18h后，按8%的接種量接入培養(yǎng)基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養(yǎng)66h后取樣測(cè)定總氮含量。