用于代謝氣體分析的化學改性微流控肺泡芯片

　　要: 基于微機電系統( MEMS) 微納加工工藝和聚二甲基硅氧烷( PDMS) 軟刻蝕技術設計制作了一種包含細胞培養腔體與化學改性氣體富集區域的多層微流控肺泡芯片，來進行片上三維細胞培養和細胞代謝的羰基氣體捕獲，并利用質譜技術對捕獲羰基氣體進行分析。實驗結果表明: 該芯片實現了肺癌細胞的片上培養，以及痕量代謝氣體捕獲。芯片結構簡單，樣品消耗小，為細胞氣體代謝分子體外分析提供了一種有效的手段。

　　本文源自魏昕鈺，李明虓 ，張靈倩 ，趙 陽 ，黃成軍 傳感器與微系統 2021 年 第 40 卷 第 6 期

　　關鍵詞: 肺癌細胞; 肺泡芯片; 化學改性; 代謝氣體分析

　　0 引 言

　　肺癌疾病的早期篩查對于此類疾病的治療具有重要意義[1]。生物學研究表明細胞的異常代謝氣體會溶于血液，通過呼吸作用排出體外。因此，對呼吸氣體的檢測結果可反映潛在病變細胞的新陳代謝水平，應用于癌癥，尤其是肺癌的篩查和診斷[2]。目前已發現超過 196 種代謝氣體與肺癌疾病相關[3]，然而這種方法缺乏理論研究和數據支持，難以用于臨床治療。因此，在細胞級別進行實驗驗證和數據支持是十分必要的。

　　微流控芯片具有集成度高，樣品消耗少等優點[4]。微通道尺寸與體內尺寸相當，可進行細胞三維培養和生物微環境模擬，構建與細胞尺度匹配的三維空間，模擬體內細胞的生長狀況，真實地反映其生物學特征，為醫學和生物學方面的研究提供一個新思路。

　　本文提出了一種結構簡單、反應靈敏的肺泡芯片。該芯片由聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微通道和聚 對 苯 二 甲 酸 乙 二醇 酯 ( polyethylene terephthalate， PET) 核孔膜組成，可實現肺癌細胞的三維培養和醛類代謝氣體的捕獲，為呼吸檢測方法提供理論支持。

　　1 芯片制備

　　1. 1 結構設計與制備

　　1. 1. 1 結構設計

　　考慮到肺泡尺寸和肺部的氣血屏障結構[5]，肺泡微流控芯片由兩層結構化 PDMS( 30 mm × 15 mm × 2 mm) 和一層PET 核孔膜( 15 mm × 5 mm × 5 μm，孔徑 5 μm) 組成，分層示意圖如圖 1 所示。

　　1. 1. 2 芯片制備

　　PDMS 結構采用軟光刻方法翻膜得到，模具為硅基結構。首先設計微通道版圖，制作掩模版。之后，通過光刻、刻蝕等工藝進行硅基圖形化。將 PDMS 預聚物和固化劑以 10︰1 的體積比充分混合，澆入硅基結構，在 80 ℃ 下烘烤固化 3 h，之后脫模切割，用直徑 3 mm 的打孔器在兩端打孔，作為細胞懸液和培養基等液體的出入口。PDMS 內部微通道的深度為 100 μm，寬度為 500 μm，長度為 15 mm，體積為 7. 5 μL( 制作工藝如圖 2( a) 所示) 。PET 核孔膜通過重離子打孔和化學擴孔的工藝方法產生[6]，如圖 2( b) 所示，膜上有致密的小孔，每個小孔的形狀和尺寸基本相同，孔徑為 7 μm。

　　PDMS-PET 層間鍵和采用化學浸泡法[7]和表面氧等離子體處理相結合的方法，用到的化學試劑為 GLYMO 和 APTES 兩種硅烷偶聯劑。具體的處理方法為: 1) 首先，用去離子水分別配制 1 % 濃度的 GLYMO 溶液和 5 % 濃度的 APTES 溶液; 2) 將 PDMS 和 PET 分別放入 1 % 的 GLYMO 溶液中和 5 % 的 APTES 溶液中，各浸泡 20 min; 之后用去離子水沖洗后吹干; 3) 將 PDMS 和 PET 的鍵合面向上，放入等離子體腔室中，進行氧等離子體表面處理，功率設置為中檔，注氧 90 s，取出后對準鍵合到一起，完成芯片制作。得到最終的芯片實物如圖 2( c) 所示。

　　1. 2 表面改性

　　1. 2. 1 化學改性原理

　　為完成代謝氣體的片內捕獲，這里使用氨氧基季銨鹽— 乙醇溶液完成 PDMS 化學改性，化學方程式為 H2NO - Z - N + /A - ，其中 Z 是連接基團，可以取代芳基、烷基或者醚類基團，A 可以是任意一種鹵族元素，如氯、溴、碘等。該分子一端的—ONH2基團可以快速與細胞代謝產生的羰基化合物發生肟化反應，得到醛肟或酮肟分子[8]，其可通過質譜檢測方法識別。肟化反應結構式如圖 3 所示。

　　1. 2. 2 改性處理方法

　　使用氨氧基季銨鹽對 PDMS 通道進行化學改性處理，改性物質化學名稱為 2—氨氧乙基季甲銨碘鹽 ( ATM) ，化學式如圖 3 所示。具體改性方法為: 1) 使用無水乙醇稀釋氨氧基鹽溶液，制備濃度為 4 mmol /L 的改性試劑; 2) 滴加 10 μL 改性試劑到 PDMS 微通道表面; 3) 待乙醇溶劑揮發后改性物質存留在通道表面，完成 PDMS 的表面修飾。

　　2 細胞實驗

　　2. 1 細胞培養

　　首先配制實驗中使用的培養基溶液。由于 PDMS 通道狹長，和傳統培養皿培養細胞的環境相比更具挑戰性，因此增加培養基中 FBS( 胎牛血清) 的比例，促進細胞的生長代謝，實驗結果證明細胞的貼壁和生長狀態較好。具體培養基配制方法為 RPMI 1640︰FBS︰雙抗 = 100︰20︰1。

　　之后進行微流控肺泡芯片的預處理，將鍵合好的芯片紫外照射 30 min 以上，之后用大量磷酸鹽緩沖液( PBS) 沖洗通道，排出溝道內氣泡; 然后用去離子水配制 20 mg /mL 的人纖連蛋白溶液緩緩注入通道內，放 入 細 胞 培 養 箱 ( 37 ℃，5 % 濃度 CO2 ) 3 h 以上; 取出芯片后，使用培養基溶液沖洗通道，將混合均勻的，密度在 106 /mL 的肺癌細胞 ( A549) 懸液注入下層通道，培養 1 天左右，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁形態和增殖情況。

　　2. 2 代謝氣體檢測

　　2. 2. 1 質譜檢測方法

　　質譜( mass spectrometry，MS) 分析利用電場和磁場將運動的離子按它們的質荷比分離后進行檢測，通過分析這些粒子可獲得化合物的分子量、化學結構等信息。實驗中使用的質譜檢測儀器為 Orbitrap Fusion LUMOs，它具有可自動進樣、電場/磁場雙模式及檢測精度高的優勢。

　　如圖 4 所示是一次實驗測得的質譜圖，設置 FTMS-pESI 模式( p 代表 positive，正離子模式) ，自動進樣 1 μL。圖中得到每個峰代表一種化合物，其中，質荷比 m/z = 119. 12 代表原始的改性物質( ATM) ，m/z = 131. 12 代表改性物質捕獲到的甲醛氣體( CH2O) ，m/z = 145. 13 代表捕獲到的乙醛氣體( C2H4O) ，m/z = 159. 15 代表捕獲到的丙酮氣體 ( C3H6O) ，m/z = 173. 17 代 表 捕 獲 到 的 2—丁 酮 氣 體 ( C4H8O) ，物質的具體結構由氣相色譜—質譜聯用( GC-MS) 得到[9]。通過觀察混合溶液中每一種化合物的峰值強度，可以得知各種化合物在混合溶液中的相對含量，以及不同控制變量下各種物質的變化。

　　2. 2. 2 實驗組測試

　　每 12 h 為溝道內的細胞更換培養基，確保細胞在溝道內有足夠的營養物質。細胞代謝氣體經過微孔膜與改性區域充分接觸。一天以后取下上層改性 PDMS，使用無水甲醇進行洗脫富集，得到 50 μL 左右的反應后溶液，將溶液進行有機質譜檢測，確定其反應后成分。

　　2. 2. 3 實驗說明

　　實驗中使用的 PET 核孔膜購自武威科近新發技術有限責任公司，細胞培養相關溶液購自 ThermoFisher，化學改性相關的試劑和溶液購自 Sigma-Aldrich，基于肟化反應的改性試劑由已公開的方法[10]合成，PDMS 預聚物及其固化劑( SYLGARD 184) 購自 TORAY( 日本) ，其他實驗中用到的儀器包括倒置顯微鏡( CX41 OLYMPUS) ，細胞培養箱 ( Thermo SCIENTIFIC) ，生物安全柜( BIOBASE BSC—1100) ，等離子體清洗機( HARRICK PLASMA) ，水浴鍋( KEWEI) 。

　　3 結果與討論

　　3. 1 改性物質在 PDMS 溝道內的氣體捕獲效果

　　在微孔膜上進行細胞培養后，細胞代謝過程中產生的羰基化合物可與改性物質結合，起到代謝氣體捕獲的作用，氣體捕獲后的 PDMS 改性區域的顯微鏡圖片如圖 5 所示 。

　　3. 2 細胞在 PDMS 溝道內的生長特性

　　實驗中使用熒光染料確定通道內細胞的生長情況: 將 10 μL Calcein-AM( 2 μmol /L ) 和 400 μL PI( 16 μg /mL ) 加入 4 590 μL PBS 溶液里混合均勻，配制成 Calcein-AM/PI ( Propidium Iodide) 細胞雙染試劑，在熒光顯微鏡下同時觀察 PDMS 通道里的活細胞和死細胞。Calcein-AM 可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用脫去 AM 基 團，產 生 的 Calcein( 鈣黃綠素) 發出強綠色熒光，因此活細胞在熒光顯微鏡下可被檢測到綠色熒光。另一方面 PI 通過受損的細胞膜進入到死細胞內并嵌入細胞的 DNA 雙螺旋從而產生紅色熒光，因此死細胞會被檢測到紅色熒光。

　　如圖 6 所示，細胞在通道內正常貼壁，形態良好，可以持續保持細胞活性，染色后發現活細胞數量較多，死細胞數量很少，證明了微流控芯片可以較好地模擬細胞生長環境，維持細胞代謝水平。

　　3. 3 實驗工藝和細胞培養對質譜檢測結果的影響評估

　　在開始肺泡芯片的實驗前，進行了對照組實驗，測試在化學改性時，PDMS 材料本身、表面氧等離子體處理、以及培養基對氣體檢測結果的影響。如圖 7 所示，對照組為改性試劑的質譜檢測結果，PDMS 組為將改性試劑滴加在 PDMS 之后重新富集的質譜結果，等離子體組為將 PDMS 注氧后滴加改性試劑再富集，而培養基組為將改性試劑混合少量培養基( ≈2 μL) 之后進行質譜分析。

　　觀察質譜圖發現，這三組實驗變量的結果與空白對照組類似，三種氣體成分的變化在實驗誤差允許的范圍內，證明 PDMS 材料本身，表面氧等離子體處理方法，以及培養基成分對實驗結果的影響較小，在實驗中可以正常使用。

　　3. 4 細胞代謝氣體捕獲成分分析

　　統計每次實驗組中捕獲的各羰基化合物成分的濃度含量，與對照組進行對比，觀察 4 種羰基化合物成分的變化，做出它們的含量增值部分曲線，如圖 8 所示。圖中可觀察到 4 種氣體含量均有所增加，氣體量級在 0 ～ 80 μmol，其中丙酮氣體增加最顯著，甲醛和乙醛氣體也有明顯增多。而分析對照組的質譜圖發現其中并未存在 2—丁酮氣體，證明細胞代謝過程也會產生少許 2—丁酮。

　　相關生物學研究表明，肺癌會誘導氧化酶的生成并帶來“氧化應激”，即機體活性氧成分與抗氧化系統之間平衡失調引起的一系列適應性的反應，這會引起特定揮發性代謝產物濃度的增高[11]。而羰基化合物氣體常在機體內生化反應過程中以中間產物形式生成，一些羰基化合物在給定的反應中具有特異性，例如脂質氧化會生成自由基。在本次實驗中，通過將微流控芯片與化學捕獲方法結合，本文進行了四種羰基標志物氣體在肺癌細胞代謝過程中的識別，結果表明肺癌細胞的生長代謝過程會生成較多的丙酮氣體、甲醛和乙醛氣體以及少量的 2—丁酮氣體。

　　4 結 論

　　介紹了一種用于細胞代謝氣體捕獲的微流控肺癌芯片，可進行細胞的片上培養和醛類代謝氣體的識別。文中使用肺癌細胞( A549) 進行實驗，芯片可以較好地完成細胞培養和氣體捕獲的功能，證明了芯片功能的有效性，為細胞代謝氣體的分析提供了一種有效的途徑，為呼吸檢測在肺癌疾病的應用提供了一定的理論依據。