轉(zhuǎn)基因(transgene)是指將人工分離和修飾過(guò)的外源或內(nèi)源基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體性狀的可遺傳修飾。生物體內(nèi)染色體復(fù)制的過(guò)程中，兩條染色體之間會(huì)發(fā)生同源重組，這一現(xiàn)象為轉(zhuǎn)基因的實(shí)現(xiàn)提供了可能。然而同源重組會(huì)導(dǎo)致染色體缺失、異位和基因失活等不利于轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生物學(xué)效應(yīng)的穩(wěn)定遺傳。早在20世紀(jì)40年代，美國(guó)遺傳學(xué)家McClintockB在研究玉米的遺傳因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些基因活性受到一些能在不同染色體間轉(zhuǎn)移的控制因子(controllingelement)所決定，這些控制因子就是轉(zhuǎn)座子。隨著對(duì)昆蟲(chóng)的深入研究，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些可以用于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究的轉(zhuǎn)座子，它們分別是:piggyBac、hyperactiveSleepingBeauty(SB11)和Tol2［1］。在這三者中，piggyBac轉(zhuǎn)座子識(shí)別位點(diǎn)5'-TTAA-3'，剪切和插入不留下印跡，且轉(zhuǎn)座效率比其他兩個(gè)高。與同源重組相比，高效位點(diǎn)特異性整合的非病毒載體-piggyBac轉(zhuǎn)座子可能更有利于定點(diǎn)整合，此外，piggyBac轉(zhuǎn)座子還是研究基因功能的一個(gè)很好的工具。

1piggyBac轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

來(lái)自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的piggyBac轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)2472bp，兩端為13bp的反向末端重復(fù)序列(ITR)和19bp的亞末端重復(fù)序列(subR)，5'反向末端重復(fù)序列(ITR)與亞末端重復(fù)序列(subR)之間有31bp，3'反向末端重復(fù)序列(ITR)與亞末端重復(fù)序列(subR)之間有3bp(圖1)［2］。piggyBac轉(zhuǎn)座子末端和亞末端重復(fù)序列都是活性自主轉(zhuǎn)座子必需的元件。在亞末端重復(fù)序列中有一個(gè)2.1kb的轉(zhuǎn)錄單位，其中有一個(gè)1.8kb的開(kāi)放閱讀框(ORF)，這個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼一個(gè)約64ku的轉(zhuǎn)座酶［3］。轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)piggyBac轉(zhuǎn)座子剪切和插入宿主基因組中，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座。

2piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座

piggyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座時(shí)，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，精確地剪切和重新插入宿主基因組中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，piggyBac轉(zhuǎn)座子表現(xiàn)出與在昆蟲(chóng)研究中具有相似的特性。

2.1piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特點(diǎn)

在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，外源基因在基因組中的定位，有利于分析陽(yáng)性克隆細(xì)胞或生物體的基因功能及其生物學(xué)效應(yīng)。然而，piggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的輔助下，特異性識(shí)別基因組中位點(diǎn)5'-TTAA-3'，并且在隨機(jī)插入基因組的過(guò)程中，更傾向于插入基因的5'非翻譯區(qū)［5］。外源基因插入宿主基因組的非編碼區(qū)，使外源基因在體內(nèi)得到表達(dá)，與同源重組相比，piggyBac轉(zhuǎn)座子更有利于轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的產(chǎn)生。piggyBac轉(zhuǎn)座子在剪切和粘貼的過(guò)程中，會(huì)越過(guò)DNA的合成，而不影響到DNA的修復(fù)或復(fù)制。piggyBac轉(zhuǎn)座子上的DNA發(fā)生甲基化時(shí)，其轉(zhuǎn)座被抑制。在老鼠的胚胎肝細(xì)胞中，piggyBac轉(zhuǎn)座子跳躍的頻率比較高，載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)反向PCR和Southernblot技術(shù)，在一些陽(yáng)性克隆細(xì)胞中，可以檢測(cè)到15個(gè)以上的拷貝數(shù)［4］。此外，piggy-Bac轉(zhuǎn)座子傾向于在局部范圍(≈100kb)內(nèi)跳躍。

2.2piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制

轉(zhuǎn)座酶能夠識(shí)別轉(zhuǎn)座子的末端反向重復(fù)序列并且在其3'端切開(kāi)，同時(shí)在轉(zhuǎn)座子的靶部位交錯(cuò)切開(kāi)單鏈，它的5'突出末端與轉(zhuǎn)座子的3'末端連接，形成Sharpin中間體。不同種類(lèi)轉(zhuǎn)座子形成與靶序列連接中間體的過(guò)程大致相同;隨后步驟各不一樣。RupakMitra等［6］推斷piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座有4個(gè)步驟(圖2)。第一步:雙鏈斷裂，在轉(zhuǎn)座子3'末端與側(cè)翼供體DNA之間產(chǎn)生一個(gè)切口，在轉(zhuǎn)座子末端暴露具有活性的3'OH。第二步:3'OH作為一個(gè)親核基團(tuán)，它與互補(bǔ)鏈上側(cè)翼供體DNA的4個(gè)核苷酸結(jié)合，在轉(zhuǎn)座子末端產(chǎn)生了一個(gè)發(fā)夾，同時(shí)轉(zhuǎn)座子從供體DNA上分離。側(cè)翼供體DNA包含互補(bǔ)的5'-TTAA，延伸能再結(jié)合修復(fù)供體缺口，從而產(chǎn)生一個(gè)精確的剪切。第三步:轉(zhuǎn)座酶破壞轉(zhuǎn)座子末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在離體線性的轉(zhuǎn)座子的5'末端留下4個(gè)核苷酸的突出端，并且在轉(zhuǎn)座子的末端再一次暴露3'OH。第四步，轉(zhuǎn)座子末端的3'OH與靶位點(diǎn)的DNA共價(jià)連接。對(duì)piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制的了解，有利于更好的用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。

3影響piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座因素

3.1轉(zhuǎn)座酶

piggyBac轉(zhuǎn)座酶是DDE重組酶超家族中的一員，在載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶載體之間劑量的不同會(huì)影響piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率。在一定劑量范圍內(nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶載體的劑量同時(shí)增加時(shí)，轉(zhuǎn)座子在宿主基因組的拷貝數(shù)會(huì)增加，然而，當(dāng)增加轉(zhuǎn)座酶載體的劑量時(shí)，pig-gyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座的頻率會(huì)下降。SareinaChiung-YuanWu等［1］發(fā)現(xiàn)piggyBac轉(zhuǎn)座酶與GAL4DNA結(jié)合區(qū)域耦合會(huì)維持piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性。此外，在轉(zhuǎn)座酶載體上，啟動(dòng)子的不同會(huì)影響轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)量，從而影響轉(zhuǎn)座效率。

3.2細(xì)胞類(lèi)型

并不是所有細(xì)胞類(lèi)型都適用于piggyBac轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這主要參考細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和細(xì)胞活力等因素。piggyBac轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng)最初運(yùn)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究時(shí)，選擇的是哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，就是根據(jù)哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞活力和無(wú)限增殖的潛能。DNA的復(fù)制觸發(fā)細(xì)胞的分裂增殖，且DNA的復(fù)制通常發(fā)生在細(xì)胞分裂的G1/S期，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座一般發(fā)生在DNA復(fù)制的過(guò)程中。DNA復(fù)制時(shí)，雙鏈解開(kāi)，DNA聚合酶和DNA結(jié)合蛋白等會(huì)與單鏈結(jié)合，促使DNA復(fù)制。同時(shí)，RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子會(huì)觸發(fā)轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)，在轉(zhuǎn)座酶的存在下，轉(zhuǎn)座子會(huì)在宿主基因組內(nèi)發(fā)生跳躍。此外，載體上piggyBac轉(zhuǎn)座子所介導(dǎo)的基因片段長(zhǎng)度大小也會(huì)影響轉(zhuǎn)座子插入和剪切的準(zhǔn)確性，會(huì)影響轉(zhuǎn)座子的整合位點(diǎn)數(shù)目。

4piggyBac轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因已經(jīng)在人和老鼠胚胎肝細(xì)胞上進(jìn)行研究，且在成年老鼠細(xì)胞中，Gaussia熒光素酶(Gluc)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間超過(guò)2個(gè)月［7］。piggyBac轉(zhuǎn)座子由于具有識(shí)別位點(diǎn)特異性和高效轉(zhuǎn)座的特點(diǎn)已成功介導(dǎo)誘導(dǎo)多潛能老鼠肝細(xì)胞(iPSCs)的產(chǎn)生［8］。Chikara等［9］將Cre/LoxP系統(tǒng)與piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合在老鼠上檢測(cè)到大量順式調(diào)控元件。Cre/LoxP系統(tǒng)與piggyBac轉(zhuǎn)座子的結(jié)合在理論上消除了piggyBac轉(zhuǎn)座酶對(duì)轉(zhuǎn)座的干擾，然而，在實(shí)際操作過(guò)程中，卻是難以避免的。昆蟲(chóng)作為一種模式動(dòng)物，其研究已經(jīng)很深入，或許我們可以借鑒Tarig等［10］的思路(圖3)，將轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行改造，從而提高轉(zhuǎn)座的穩(wěn)定性。質(zhì)粒是由兩對(duì)相反的轉(zhuǎn)座子末端組成，分別是A、B、C和D。這樣就有4個(gè)潛在的轉(zhuǎn)座子(A-D，A-B，C-D和C-B)。通過(guò)對(duì)標(biāo)記基因M2的篩選，期望的A-D轉(zhuǎn)座子插入到宿主基因組中。原理上，側(cè)翼的A-B和C-D轉(zhuǎn)座子通過(guò)再一次暴露在轉(zhuǎn)座酶的環(huán)境下而被切除，最后插入的片段因?yàn)闆](méi)有轉(zhuǎn)座子的末端，所以轉(zhuǎn)座酶對(duì)插入的片段沒(méi)有剪切作用。