紅肉蘋果果實(shí)酚類物質(zhì)含量及抗氧化性測(cè)定

　　摘要：以紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛成熟果實(shí)為試材，以紅富士為對(duì)照，對(duì)各品種蘋果果皮、果肉中的總酚、總黃酮、總花青素含量以及DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力(FRAP)、ABTS+•自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，分析酚類物質(zhì)含量與抗氧化性的相關(guān)性。結(jié)果表明，紅肉品種紅滿堂、紅色之愛果實(shí)中總酚、總黃酮、總花青素含量及其抗氧化性均極顯著高于紅富士對(duì)照，且紅滿堂極顯著高于紅色之愛;各品種果皮中總酚、總黃酮、總花青素含量及其抗氧化性均顯著高于果肉;酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力之間存在顯著相關(guān)性。紅滿堂果實(shí)具有高的酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力，可以作為高類黃酮加工型品種進(jìn)行開發(fā)利用。

　　本文源自山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,48(11):1763-1766+1776.《山西農(nóng)業(yè)科學(xué)》(月刊)創(chuàng)刊于1961年，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院主辦。主要刊載生物技術(shù)、遺傳育種、耕作栽培、生理生化、資源與環(huán)境、植物保護(hù)、貯藏加工、畜牧獸醫(yī)等學(xué)科的研究報(bào)告、學(xué)術(shù)論文及綜合述評(píng)等。

　　蘋果(MalusdomesticaMill.)是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物，屬于落葉喬木，在我國(guó)已經(jīng)有2000多年的栽培歷史[1]。蘋果酸甜清香，不僅含有蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸、維生素和微量元素等，還含有多酚、類黃酮等功能性物質(zhì)。其中，酚酸、黃酮類物質(zhì)及花青素等是蘋果中主要的酚類物質(zhì)[2]。對(duì)藍(lán)靛果[3]、獼猴桃[4]、杏[5]、藍(lán)莓[6]的研究表明，酚類物質(zhì)具有強(qiáng)的抗氧化功能，有益人類健康[7]。

　　“醫(yī)食同源”是目前果業(yè)的發(fā)展方向，“吃營(yíng)養(yǎng)，吃健康”已經(jīng)成為人們的共識(shí)[8]。紅肉蘋果(MaluspumilaMill.)是新疆野蘋果的一個(gè)變種，原產(chǎn)我國(guó)新疆伊犁地區(qū)以及中亞的哈薩克斯坦等地[9]，具有酚類物質(zhì)含量高的特點(diǎn)。因此，有效利用新疆野蘋果等種質(zhì)資源，開展遠(yuǎn)緣雜交育種，進(jìn)一步培育高類黃酮(紅肉與紅皮)蘋果，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展及“健康中國(guó)”均具有重要意義[10]。

　　本研究以紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛(RedLove)成熟果實(shí)為試材，以紅富士為對(duì)照，測(cè)定3個(gè)品種的總酚、總黃酮、總花青素含量以及抗氧化性，并對(duì)酚類物質(zhì)含量與抗氧化性進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在篩選出高類黃酮、高抗氧化品種。

　　1、材料和方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　試驗(yàn)所用蘋果品種(圖1)為紅肉品種紅滿堂、紅色之愛(RedLove)，以白肉品種紅富士為對(duì)照，均采摘成熟期果實(shí)。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　每個(gè)蘋果品種選取5株長(zhǎng)勢(shì)基本一致、生長(zhǎng)發(fā)育良好的樹，在樹冠外圍隨機(jī)采取果實(shí)20個(gè)。單株小區(qū)，5次重復(fù)。果實(shí)通過清洗、擦干，取薄厚一致的果皮(約1.0mm)及去核果肉，用液氮速凍后冷凍研磨儀粉碎成細(xì)粉，稱質(zhì)量分裝，存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.1 酚類物質(zhì)的提取

　　參照汪曉謙[11]的方法提取。以70%甲醇內(nèi)含2%甲酸的混合溶液為提取液。提取時(shí)，稱取果皮或果肉0.1g，在0℃下加1mL提取液研磨之后再加1mL提取液沖洗研缽，將2次加入的提取液并入離心管。將離心管于25℃、1000r/min條件下振蕩30min，之后在10000g下離心10min，取上清液待用。

　　1.2.2 總酚含量的測(cè)定

　　總酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[12]。在離心管中依次加入20μL果實(shí)提取液、1.58mL蒸餾水、0.1mLFolin-Ciocalteu試劑(1∶1稀釋)，搖勻，充分反應(yīng)1min后加入飽和Na2CO3溶液1.5mL，避光反應(yīng)2h。以提取溶劑為對(duì)照，用分光光度計(jì)在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示，單位為mg/g。

　　1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定

　　總黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[13]。在離心管中依次加入0.5mL果實(shí)提取液、0.15mL5%NaNO2溶液，靜置6min后加入0.15mL10%Al(NO3)3溶液，靜置6min后加入2mL4%NaOH溶液，最后加入2.2mL蒸餾水，振蕩混勻靜置3min后于508nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量(RE)表示，單位為mg/g。

　　1.2.4 總花青素含量的測(cè)定

　　總花青素含量的測(cè)定采用pH示差法。取果實(shí)提取液2mL至10mL試管中，分別用pH=1.0(0.2mol/LKCl∶0.2mol/LHCl=25∶67,V/V)、pH=4.5(醋酸-醋酸鈉緩沖液：取18g醋酸鈉，加冰醋酸9.8mL，再加水稀釋至1000mL)的緩沖液定容，反應(yīng)30min，用紫外分光光度計(jì)在510、700nm處測(cè)定吸光度，以矢車菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式進(jìn)行花青素含量測(cè)定，單位為mg/kg。

　　式中，A為待測(cè)液花青素總吸光度;ΔApH1為pH值為1條件下的吸光度差值;ΔApH4.5為pH值為4.5條件下的吸光度差值;A510為待測(cè)液花青素在510nm處的吸光度;A700為待測(cè)液花青素在700nm處的吸光度;c為待測(cè)液花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù);V為提取液總體積(mL);DF為稀釋倍數(shù);M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449.2g/mol);ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(29600L/(mol·cm));m為樣品質(zhì)量(g);L為光程(1cm)。

　　1.2.5 DPPH法測(cè)定抗氧化性

　　DPPH法測(cè)定抗氧化活性參照Z(yǔ)HANG等[14]的方法。用無水乙醇溶解DPPH，使溶液的物質(zhì)的量濃度達(dá)到0.1mmol/L，配制完成后置于包裹錫箔紙的燒瓶中，4℃暗保存。測(cè)定時(shí)取0.1mL待測(cè)樣品，加入4mL0.1mmol/LDPPH溶液，充分振蕩30s，暗反應(yīng)30min之后，于517nm處測(cè)定吸光度。

　　繪制抗壞血酸的自由基清除率相對(duì)于其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DPPH抗氧化活性單位為mg/100g。

　　1.2.6 FRAP法測(cè)定抗氧化性

　　FRAP法測(cè)定抗氧化活性參照Z(yǔ)HANG等[14]的方法。FRAP儲(chǔ)備液由300mmol/L乙酸鈉緩沖液(3.1gC2H3NaO2·3H2O+16mLC2H4O2,pH=3.6)、10mmol/LTPTZ溶液(溶于40mmol/LHCl)以及20mmol/LFeCl3·6H2O這3種溶液按照10∶1∶1的體積比混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。測(cè)定時(shí)，取20μL果實(shí)提取液加入1mL水與2mLFRAP儲(chǔ)備液，充分混合，于37℃反應(yīng)10min后，在593nm處測(cè)定吸光度。

　　繪制以水溶性維生素E(Trolox)為標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的FRAP抗氧化活性單位為mg/100g。

　　1.2.7 ABTS法測(cè)定抗氧化性

　　ABTS法測(cè)定抗氧化活性參照AMIR等[15]的方法，略有改動(dòng)。ABTS+·儲(chǔ)備液由5mL7mmol/LABTS溶液和5mL2.45mmol/LK2S2O8溶液混合之后，于室溫暗反應(yīng)12h后制成。測(cè)定時(shí)用乙醇稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液，于734nm處測(cè)得0.70±0.02的吸光度。之后將50μL果實(shí)提取液與4mL乙醇稀釋后的ABTS+·儲(chǔ)備液混合，避光反應(yīng)6min后于734nm處測(cè)定吸光度。樣品的ABTS抗氧化性單位為mg/100g。

　　1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

　　試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin2018制圖，運(yùn)用SAS8.1軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，運(yùn)用SPSS21軟件中Pearson函數(shù)對(duì)總酚含量、總黃酮含量、總花青素含量與以DPPH法、FRAP法、ABTS法測(cè)定的抗氧化性之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算。

　　2、結(jié)果與分析

　　2.1 紅肉蘋果果實(shí)酚類物質(zhì)含量分析

　　由圖2-A可知，紅滿堂果皮總酚含量最高，為9899.99mg/kg，極顯著高于紅色之愛(8474.12mg/kg)和紅富士(7563.81mg/kg);紅滿堂果肉總酚含量最高，為4124.74mg/kg，極顯著高于紅色之愛(3614.01mg/kg)和紅富士(2627.64mg/kg)。

　　從圖2-B可以看出，紅滿堂果皮總黃酮含量最高，為39459.77mg/kg，極顯著高于紅色之愛(25546.51mg/kg)和紅富士(21022.64mg/kg);紅滿堂果肉總黃酮含量最高，為15455.34mg/kg，極顯著高于紅色之愛(11486.47mg/kg)和紅富士(7697.58mg/kg)。

　　從圖2-C可以看出，紅滿堂果皮總花青素含量最高，為499.68mg/kg，極顯著高于紅色之愛(271.19mg/kg)和紅富士(201.67mg/kg);紅滿堂果肉總花青素含量最高，為135.37mg/kg，極顯著高于紅色之愛(58.88mg/kg)和紅富士(35.98mg/kg)。

　　3個(gè)品種總酚、總黃酮、總花青素含量均表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

　　2.2 紅肉蘋果果實(shí)抗氧化性分析

　　由圖3-A可知，紅滿堂果皮DPPH自由基清除能力最強(qiáng)(510.47mg/100g)，極顯著高于紅色之愛(318.51mg/100g)和紅富士(170.59mg/100g);紅滿堂果肉DPPH自由基清除能力最強(qiáng)(439.04mg/100g)，極顯著高于紅色之愛(248.37mg/100g)和紅富士(71.94mg/100g)。

　　由圖3-B可知，紅滿堂果皮FRAP抗氧化能力最強(qiáng)，為381.39mg/100g，極顯著高于紅色之愛(303.60mg/100g)和紅富士(108.80mg/100g);紅滿堂果肉FRAP抗氧化能力最強(qiáng)，為238.51mg/100g，極顯著高于紅色之愛(89.55mg/100g)和紅富士(52.65mg/100g)。

　　由圖3-C可知，紅滿堂果皮ABTS+·自由基清除能力最強(qiáng)，為581.61mg/100g，極顯著高于紅色之愛(515.33mg/100g)和紅富士(214.12mg/100g);紅滿堂果肉ABTS+·自由基清除能力最強(qiáng)，為365.29mg/100g，極顯著高于紅色之愛(244.51mg/100g)和紅富士(143.82mg/100g)。

　　3個(gè)品種DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力、ABTS+·自由基清除能力都表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

　　2.3 果實(shí)酚類物質(zhì)含量與抗氧化性的相關(guān)性分析

　　對(duì)果實(shí)酚類物質(zhì)(總酚、總黃酮、總花青素)含量與抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，果皮中總酚、總黃酮和總花青素含量都與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關(guān);果皮中總酚與FRAP抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，總黃酮、總花青素與FRAP抗氧化能力不存在顯著相關(guān)性;果皮中總酚含量與ABTS+·自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)，總黃酮、總花青素與ABTS+·自由基清除能力呈顯著正相關(guān)。

　　果肉中總酚、總黃酮、總花青素含量與3個(gè)抗氧化指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)。

　　3、結(jié)論與討論

　　HU等[16]對(duì)蘋果果實(shí)酚類物質(zhì)研究表明，蘋果屬植物在不同組織中，其含量具有顯著差異。HOLDERBAUM等[7]對(duì)蘋果酚類物質(zhì)分布的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果果皮中總酚含量大于果肉中含量。本研究結(jié)果表明，紅肉蘋果紅滿堂果實(shí)中酚類物質(zhì)含量極顯著高于紅色之愛和紅富士，且3個(gè)品種果皮中酚類物質(zhì)含量均顯著高于果肉中含量，這一結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。

　　本試驗(yàn)對(duì)蘋果果實(shí)DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化(鐵離子還原)能力以及ABTS+·自由基清除能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明，紅肉蘋果紅滿堂、紅色之愛果實(shí)的DPPH自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP抗氧化能力極顯著高于紅富士，且紅滿堂極顯著高于紅色之愛。前人研究的結(jié)果表明，蘋果抗氧化性與蘋果酚類物質(zhì)組成及含量密切相關(guān)，酚類物質(zhì)越豐富，蘋果的抗氧化性越強(qiáng)[17]。本研究通過對(duì)果實(shí)酚類物質(zhì)(總酚、總黃酮、總花青素)含量與抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果也支持了此結(jié)果。紅滿堂果實(shí)高的酚類物質(zhì)含量及其高的抗氧化性，說明紅滿堂可作為加工型高酚類品種進(jìn)行開發(fā)利用。紅滿堂是以舞美、山定子為親本雜交選育出的新型紅肉品種，其果實(shí)自幼果期直至成熟期均為紫紅色，果汁呈血紅色[18]，果肉不易褐變，可做天然藥妝品。本研究進(jìn)一步為紅滿堂的開發(fā)利用提供了理論支撐。

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