植原體對(duì)冬棗根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌菌群的影響

　　摘 要：棗瘋病是棗樹(shù)上由植原體引起的一種毀滅性病害，但有關(guān)棗瘋病植原體與寄主根部?jī)?nèi)生細(xì)菌間的相關(guān)性鮮有研究。本試驗(yàn)采用常規(guī)分離培養(yǎng)方法從春季冬棗根部分離純化內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增出內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因的DNA片段，測(cè)序后利用NCBI中的BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)，對(duì)健康和感病冬棗樹(shù)根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)二者對(duì)比結(jié)果初步判斷植原體對(duì)冬棗根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌菌群的影響。

　　《甘肅農(nóng)業(yè)》本刊報(bào)道的范圍是：農(nóng)業(yè)科技研究與生產(chǎn)技術(shù)動(dòng)態(tài)，如新成果、新理論、新經(jīng)驗(yàn)、新技術(shù)、新工藝、新產(chǎn)品;有關(guān)熱帶可持續(xù)農(nóng)業(yè)理論和實(shí)踐研究論文。

　　結(jié)果表明，健康冬棗樹(shù)分離出18個(gè)菌株，鑒定出6個(gè)屬(除2個(gè)僅鑒定到科水平外)的內(nèi)生細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)6株、假單胞菌屬(Pseudomonas)5株、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)2株、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)1株、志賀氏菌屬(Shigella)1株、埃希氏菌屬(Escherichia)1株;感病冬棗樹(shù)分離出17個(gè)菌株，鑒定出2個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)10株和假單胞菌屬(Pseudomonas)7株;感病冬棗樹(shù)根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌菌群屬水平較健康冬棗樹(shù)減少4個(gè)屬，說(shuō)明棗瘋病導(dǎo)致冬棗根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌群在屬水平上的降低。

　　關(guān)鍵詞：棗瘋病;內(nèi)生細(xì)菌;16S rRNA基因

　　棗(Ziziphus jujube Mill)是鼠李科棗屬植物，屬于溫帶落葉小喬木，生長(zhǎng)于海拔1 700 m以下的山區(qū)、丘陵或平原，適應(yīng)性強(qiáng)、種植范圍廣，是我國(guó)特色優(yōu)勢(shì)果樹(shù)和第一大干果樹(shù)種，在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要地位。據(jù)記載，我國(guó)棗樹(shù)的種植栽培已有3千～4千年的歷史，棗樹(shù)資源豐富，品種優(yōu)良[1]。棗瘋病是一種由植原體引起的高致死傳染性病害，幾乎分布于國(guó)內(nèi)外所有棗樹(shù)分布區(qū)，且絕大多數(shù)早熟品種對(duì)其敏感，棗樹(shù)一旦染病，通常幼樹(shù)1～2年、成齡樹(shù)3～5年即逐漸枯死，早在1951年，我國(guó)很多地區(qū)就發(fā)現(xiàn)有棗瘋病危害，現(xiàn)仍是棗業(yè)發(fā)展的一大障礙[2]。

　　植原體最早是在桑樹(shù)萎縮病等病株的篩管切片中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)相關(guān)學(xué)者系統(tǒng)地比較研究，確定了棗瘋病是由植原體感染引起，而不是病毒或病毒與植原體復(fù)合侵染所造成的結(jié)果，而關(guān)于植原體引起黃化的作用機(jī)制主要是其在篩管細(xì)胞中大量增殖引起阻塞所致[3-4]。劉棟等[5]通過(guò)對(duì)發(fā)病葉片組織結(jié)構(gòu)比較分析，結(jié)果揭示了棗瘋病發(fā)病后葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂，甚至某些特殊結(jié)構(gòu)缺失等。

　　棗瘋病防治相關(guān)研究主要集中在抗棗瘋病新品種品系的選育、藥物治療等方法，但新品種需要較長(zhǎng)時(shí)間，而且抗病性易被克服，藥物治療持續(xù)時(shí)間短，易復(fù)發(fā)[6-7]。植物內(nèi)生菌(Endophyte)是植物組織內(nèi)的正常菌群，也是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，不僅包括互惠共利和中性的內(nèi)共生微生物，而且包括潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物[8]。作為一種新的生物資源，植物內(nèi)生菌可通過(guò)多種途徑抑制病原菌生長(zhǎng)，達(dá)到防治病害的目的，例如產(chǎn)生抗生素類(lèi)、水解酶類(lèi)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物堿類(lèi)物質(zhì)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等，故可用于防治植物病害，尤其是化學(xué)防治較為困難的植物病害[9-10]。但目前尚未有關(guān)于棗瘋病植原體與寄主根部?jī)?nèi)生細(xì)菌間相關(guān)性研究，鮮有針對(duì)于棗瘋病植原體生物防治方面的研究。

　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)春季棗瘋病植原體主要從根部組織通過(guò)維管束組織進(jìn)入植株上部幼嫩組織如幼芽和葉片中[5]。根部是植原體主要過(guò)冬場(chǎng)所，因此，本研究采集健康及染棗瘋病的冬棗樹(shù)根部組織，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)及形態(tài)和分子鑒定，研究健康及染棗瘋病的冬棗樹(shù)根部?jī)?nèi)生菌種類(lèi)多樣性，為冬棗病害防治提供研究基礎(chǔ)。

　　1 材料和方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　試驗(yàn)材料取自天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)棗園，在同地塊中選取健康冬棗樹(shù)和感染棗瘋病冬棗樹(shù)，每3株植株根部組織合并為1個(gè)樣品，分別將健康冬棗樹(shù)(Z)和感染棗瘋病冬棗樹(shù)(B)的根部清洗干凈，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 先將健康和感染棗瘋病的冬棗樹(shù)根部組織用自來(lái)水清洗，去除表面的泥土，用濾紙吸干或晾干殘留的水分后，用天平分別稱(chēng)取0.2 g根部組織。在超凈工作臺(tái)下，將根部完全浸泡在75%的乙醇溶液10 min，再用無(wú)菌水洗3～4次，將最后1次清洗的水涂布在LB平板上用來(lái)檢查滅菌的效果。將表面消毒干凈的根部組織用滅過(guò)菌的剪刀剪碎置于無(wú)菌研缽中，加入1 mL無(wú)菌水充分研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，1 000 r·min-1離心1 min去除大部分根部組織，取上清液進(jìn)行梯度稀釋10-1～10-3，每個(gè)梯度取100 μL涂布在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌落的生長(zhǎng)狀況。

　　待內(nèi)生菌長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征分別挑取不同類(lèi)形的內(nèi)生細(xì)菌，在LB固體培養(yǎng)基中用平板劃線法反復(fù)純化，直到在平板表面長(zhǎng)出單菌落后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2 革蘭氏染色 為更好地觀察內(nèi)生細(xì)菌的菌體形態(tài)，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色[11]，通過(guò)鏡檢對(duì)分離出的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定。

　　1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌DNA的提取 在超凈工作臺(tái)下，在酒精燈5 cm附近將液體LB培養(yǎng)基倒入無(wú)菌試管中，用無(wú)菌接種針挑取內(nèi)生細(xì)菌的單菌落放于試管中，放置于33 ℃的搖床(200 r·min-1)搖培10 h。用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。將最后洗脫的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.4 PCR擴(kuò)增16S rRNA的DNA片段 以冬棗樹(shù)根部組織分離出內(nèi)生細(xì)菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　引物序列為：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

　　1 492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)

　　PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。

　　PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)圖1。

　　PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×DNA Loading Buffer混合后加入1.0%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣電泳。待DNA跑至凝膠中央時(shí)結(jié)束電泳，Goldview染色劑染色10 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)電泳條帶并攝影記錄。

　　將PCR獲得的產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序，將所得的各個(gè)菌株的基因序列測(cè)序結(jié)果在NCBI (https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出與其同源性最高的已知序列，根據(jù)Clarridge[12]提出的16S rRNA基因序列同源性高于99%可確定種，同源性在95%～99%之間可確定屬的原則，初步確定所測(cè)菌株的分類(lèi)地位。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

　　觀察健康和染病冬棗樹(shù)分離出的內(nèi)生細(xì)菌(圖2)可以發(fā)現(xiàn)，在涂布了健康和染病冬棗樹(shù)菌液的培養(yǎng)皿上，均長(zhǎng)出了大量細(xì)菌菌落，說(shuō)明冬棗樹(shù)的根部組織存在著豐富的內(nèi)生細(xì)菌;從健康冬棗樹(shù)和染病冬棗樹(shù)根部組織分離出來(lái)的內(nèi)生細(xì)菌菌落形態(tài)看，健康冬棗樹(shù)比染病冬棗樹(shù)分離出來(lái)的內(nèi)生細(xì)菌的豐富度要大;分離得到的內(nèi)生細(xì)菌根據(jù)形態(tài)差異進(jìn)行平板劃線純化，各內(nèi)生菌菌株生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)存在差異，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和再分離純化，最終獲得正常冬棗樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌18個(gè)菌株(Z1～Z18號(hào))，染病冬棗樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌17個(gè)菌株(B1～B17號(hào))。

　　2.2 革蘭氏染色結(jié)果

　　將分離得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了革蘭氏染色，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定，其中紫色為陽(yáng)性菌，紅色為陰性菌。由革蘭氏染色結(jié)果(表2)可知，革蘭氏陽(yáng)性菌共有16個(gè)菌株，革蘭氏陰性菌共有19個(gè)菌株;健康植株根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌株中12株為革蘭氏陰性菌，6株為革蘭氏陽(yáng)性菌，而發(fā)病植株根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌株中7株為革蘭氏陰性菌，10株為革蘭氏陽(yáng)性菌。

　　2.3 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

　　將分離出來(lái)的內(nèi)生細(xì)菌的DNA作為模板，引物以27 F/1 492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳。結(jié)果(圖3、圖4)顯示，健康冬棗樹(shù)和染病冬棗樹(shù)都跑出了約為1 500 bp左右的目的條帶，說(shuō)明PCR擴(kuò)增出了內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA基因的DNA片段。